Analisi in fluorescenza del danno genomico mediante conta dei foci γH2AX

In queste foto vengono mostrati nuclei in cui si rileva la presenza di foci γH2AX, indicatori di danno nucleare. Sono evidenziate le diverse situazioni che possono rendersi evidenti durante l’osservazione microscopica ossia: un nucleo leggermente danneggiato, uno moderatamente danneggiato ed uno gravemente danneggiato

.

Figura 26,27,28 Nuclei in fluorescenza al filtro FITC in cui sono visibili i foci γH2AX: si osserva un nucleo leggermente danneggiato, un nucleo moderatamente danneggiato ed un nucleo gravemente danneggiato.

Il primo parametro analizzato per valutare il danno spontaneo nei linfociti dei soggetti presi in esame è la percentuale di cellule H2AX positive (presenza di almeno uno spot fluore- scente altresì indicata come % cellule+). Dall’analisi multivariata effettuata, che considera l’effetto congiunto di età gestazionale, sesso e tempo di gestazione, non emergono diffe- renze nel numero delle lesioni spontanee per le diverse variabili categoriche analizzate (Tabella 7 e Figura 29). Sebbene non ci sia significatività si può osservare comunque un incremento del danno un mese dopo la nascita.

Tabella 7 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, che tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% cellule γH2AX+)

*n.s.= non significativo

Figura 29 In questo grafico si possono osservare le differenze relative ai diversi gruppi analizzati per la percentuale di cellule γH2AX+

% Cellule H2AX+ Medie± E.S P-value

Età Gestazionale AGA 2,72± 0,23 n.s.* SGA 2,86± 0,71 LGA 5,3 Campionamento Prelievi effettuati alla nascita 2,49± 0,27 n.s.* Prelievi effettuati un mese dopo la nascita 3,43±0,38 Sesso Maschi 3,05±0,32 n.s.* Femmine 2,85±0,38 Tempo di Gestazione Pretermine 2,80±0,41 n.s.* Termine 3,19±0,28

Come precedentemente descritto per il marcatore di danno ossidativo, sono state effettute analisi di regressione multipla con i descrittori dell’età gestazionale. Non sono emerse correlazioni significative per nessuno dei parametri analizzati

Il secondo parametro preso in considerazione è il numero medio di foci su tutti i nuclei osservati (foci γH2AX/N), il quale ci permette di quantificare ulteriormente il danno al DNA (Tabella 8 e Figura 30). L’analisi multivariata evidenzia un’aumento statisticamente significativo del numero di foci per nucleo nel gruppo dei neonati a termine rispetto ai pretermine e nei neonati al primo campionamento rispetto ai neonati al secondo campionamento. Contemporaneamente risultano significative anche le differenze tra neonati classificati come AGA, SGA ed il soggetto LGA. In particolare la significatività è determinata dai confronti tra il neonato LGA e i neonati SGA e AGA con p <0,001. Le medie dei gruppi AGA e SGA non sono risultate significativamente differenti. Non si sono osservate differenze significative tra maschi e femmine nei livelli del marcatore.

Tabella 8 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, che tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% foci γH2AX\N)

*n.s.=non significativo

% foci γH2AX/N Medie± E.S P-value

Età Gestazionale AGA 5,2± 0,53 0,0000 SGA 6,3± 1,6 LGA 35 Campionamento Prelievi effettuati alla nascita 5,79± 1,15 0,0108 Prelievi effettuati a un mese dalla nascita 6,3±0,87 Sesso Maschi 6,83±1,2 n.s.* Femmine 4,69±0,72 Tempo di Gestazione Pretermine 5,08±0,72 0,0451 Termine 6,95±1,4

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 30 In questo grafico si possono osservare le differenze relative ai diversi gruppi analizzati per la percentuale di foci γH2AX\N

Si è cercato quindi di verificare le differenze nel numero dei foci per nucleo entro i gruppi analizzati che hanno mostrato differenze significative nell’analisi multivariata. Si sono osservati aumenti statisticamente significativi nel numero medio di foci accesi per nucleo per i neonati SGA a un mese dalla nascita, e per i neonati SGA a termine rispetto ai neonati pretermine (Tabella 9 e Figura 31). Lo stesso tipo di analisi ripetute per i neonati AGA non ha permesso di osservare differenze significative tra primo e secondo campionamento.

Tabella 9 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Small for Gestational Age (SGA). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% foci γH2AX\N).

*n.s.= non significativo.

Neonati piccolo per l’età gestazionale Sottopeso (SGA)

% foci γH2AX\N Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

3,46± 1,07

0,0152

Prelievi effettuati a un mese dalla nascita

7,03±2,16 Sesso Maschi 6,33±2,3 n.s.* Femmine 5,71±1,23 Tempo di Gestazione Pretermine 4,7±1,43 0,0178 Termine 7,6±2,91

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 31 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati Small for Gestational Age (SGA) relativamente alla percentuale di Foci γH2AX\N

È stata quindi eseguita un’analisi multivariata sul gruppo dei neonati a termine al fine di osservare differenze significative tra primo e secondo campionamento (Tabella 10 Figura 32). Tale analisi è stata corretta per le variabili età gestazionale e sesso. Risultano innanzitutto significative le differenze tra i neonati classificati come AGA, SGA ed il soggetto LGA. In particolare la significatività è determinata dai confronti tra il soggetto LGA e i neonati SGA e AGA con p<0,001. Il confronto tra AGA e SGA non ha dato invece differenze significative. Inoltre neonati a termine campionati un mese dopo la nascita mostrano percentuali di foci accesi per cellula più alte rispetto a neonati campionati alla nascita.

Tabella 10 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati a termine (>37 settimane). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (% foci γH2AX\N)

*n.s.= non significativo

Figura 32 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati a Termine (>37 settimane) relativamente alla percentuale di Foci γH2AX\N

Come per le precedenti analisi si è cercato di definire una relazione tra la percentuale di foci accesi per nucleo e i parametri di crescita del neonato. Si può osservare che il numero di foci per nucleo aumentava in maniera significativa all’aumentare dello z-score (p=0,0167) e, sebbene in maniera non significativa, della circonferenza cranica (p=0,0616). Inoltre è stata rilevata una correlazione negativa ma non significativa con la lunghezza alla nascita (p=0,0656) (Figure 33-35): all’aumentare della lunghezza del neonato diminuisce l’entità del danno nucleare.

Nati a termine (>37 settimane) % foci γH2AX\N

Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

5,95± 1,77

0,0022

Prelievi effettuati a un mese dalla nascita

9,99±1,99 Sesso Maschi 7,8±1,99 n.s.* Femmine 4,7±0,88 Età Gestazionale AGA 5,2±1,77 0,0000 SGA 7,6±1,99 LGA 35

Figura 33 Correlazione positiva tra il numero di foci per nucleo e z-score

Figura 34 Correlazione tra il numero di foci per nucleo e la circonferenza cranica alla nascita

L’ultimo parametro posto in analisi è in numero medio di foci per cellula γH2AX positiva (Tabella 11 e Figura 36). L’analisi multivariata ha rilevato una differenza significativa tra neonati classificati come AGA, SGA, ed il soggetto LGA. In particolare la significatività è determinata dai confronti tra il soggetto LGA ed i neonati SGA e AGA con p<0,001. Il confronto tra le medie dei gruppi AGA e SGA, dei nati a termine e dei nati pretermine e dei neonati campionati alla nascita e un mese dopo la nascita non ha dato invece differenze significative.

Tabella 11 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, che tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (n. medio foci\ cellula+)

n.s *= non significativo

n.mediofoci γH2AX\cellula+ Medie± E.S P-value

Età Gestazionale AGA 2,53± 0,29 0,0196 SGA 1,78± 0,49 LGA 6,73 Campionamento Prelievi effettuati alla nascita 2,78± 0,12 n.s.* Prelievi effettuati a un mese 2,15±0,32 Sesso Maschi 2,15±1,08 n.s.* Femmine 3,04±1,64 Tempodi Gestazione Pretermine 2,10±0,38 n.s.* Termine 2,75±0,36

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 36 In questo grafico si possono osservare le differenze relative ai diversi gruppi analizzati per il N medio di foci γH2AX per cellula+.

Si sono cercate quindi differenze tra primo e secondo campionamento entro i gruppi dei neonati AGA e SGA, dei nati a termine e pretermine. Non si sono evidenziate differenze significative per i neonati SGA (Tabella 12 Figura 37; Tabella 13 Figura 38).

Tabella 12 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Appropriate for Gestational Age (AGA). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (n medio foci per cellula γH2AX+)

*n.s.= non significativo

Neonati adeguati per l’età gestazionale Normopeso (AGA) N. mediofoci γH2AX\cellula+ Medie± E.S P-value Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

2,82± 0,44

n.s.* Prelievi effettuati a

un mese dalla nascita

2,23±0,36 Sesso Maschi 1,98±0,19 n.s.* Femmine 3,49±0,65 Tempo di Gestazione Termine 2,39±0,49 n.s.* Pretermine 2,65±0,34

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 37 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate per il gruppo dei neonati Appropriate for Gestational Age (AGA) relativamente alla percentuale di cellule ossidate.

Tabella 13 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Small for Gestational Age (SGA). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (N medio foci cellula γH2AX+)

n.s* = non significativo

Neonati piccoli per l’età gestazionale Sottopeso (SGA) N mediofoci γH2AX\cellula+ Medie± E.S P-value Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

1,33± 0,17

n.s.* Prelievi effettuati a

un mese dalla nascita

1,97±0,70 Sesso Maschi 2,00±0,70 n.s.* Femmine 1,25±0,05 Tempo di Gestazione Termine 1,24±0,04 n.s.* Pretermine 2,32±0,97

Figura 38 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati Small for Gestational Age (SGA) relativamente al N medio foci cellula γH2AX+.

Diversamente da questi il gruppo dei neonati pretermine mostra differenze significative tra neonati campionati alla nascita e neonati campionati un mese dopo. Non si osservano differenze significative per le altre variabili prese in esame (Tabella 14 e Figura 39)

Tabella 14 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati Pretermine (<37 settimane). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Età Gestazionale, Campionamento, Sesso, Tempo di Gestazione) sulla variabile dipendente (N medio foci cellula γH2AX+)

Pretermine (<37 settimane) N mediofoci γH2AX\cellula+ Medie± E.S P-value Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

4,74± 1,71

0,0084

Prelievi effettuati a un mese dalla nascita

1,63±0,23

Sesso

Maschi 1,54±0,14 n.s.*

Femmine 2,94±0,89 Età Gestazionale AGA 2,39±0,49

n.s.*

*n.s = non significativo

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 39 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati Pretermine (<37 settimane) relativamente al N medio foci cellula γH2AX+.

Il gruppo dei neonati a termine mostra differenze significative nel numero di foci accesi per cellula γH2AX positiva tra primo e secondo campionamento (Tabella 15 Figura 43).

Tabella 15 Nella tabella sono riportate le medie dei gruppi analizzati mediante analisi della varianza multifattoriale, eseguita per il gruppo dei neonati a termine (>37 settimane). L’analisi tiene conto dell’effetto delle variabili utilizzate nel nostro studio (Campionamento, Sesso, Età Gestazionale,) sulla variabile dipendente (N medio foci cellula γH2AX+).

Neonati a termine (>37 settimane)

N mediofoci γH2AX\cellula+ Medie± E.S

P-value

Campionamento

Prelievi effettuati alla nascita

2,46± 0,38

0,0134

Prelievi effettuati a un mese dalla nascita

3,63±0,83

Sesso

Maschi 2,59±0,41

n.s.* Femmine 3,15±0,75

Età Gestazionale AGA 2,65±0,34

n.s.*

SGA 2,32±0,97

*n.s.= non significativo

*Gli asterischi denotano un valore di p<0,05

Figura 40 In questo grafico si possono osservare le differenze per le variabili analizzate il gruppo dei neonati a termine (>37 settimane) relativamente al N medio foci cellula γH2AX+.

Si è cercato infine di valutare l’effetto che parametri di crescita registrati per i diversi gruppi di neonati campionati hanno sul numero medio di foci accesi per cellula positiva. Le analisi condotte mostrano una chiara relazione positiva tra il marcatore e la lunghezza alla nascita (p= 0,0031) e lo z-score (p=0,0239) e sebbene in maniera non significativa una correlazione positiva si è osservata anche per i giorni di gestazione (p=0,1457) (Figure 41-43)

Figura 42 Correlazione positiva tra il numero medio di foci per cellula γH2AX+ e Z-score