2. Materiali e Metodi
3.9 Analisi della sequenza del promotore di CYP11A1
Dati precedenti avevano evidenziato che il trattamento con IL-1 delle cellule C20 promuove la traslocazione nel nucleo del fattore di trascrizione NF-kB, notoriamente considerato uno dei principali mediatori della risposta di questo stimolo immunogeno. Questa precedente evidenza e il dato ottenuto nella presente tesi che ha dimostrato l’aumento dell’espressione di CYP11A1 durante uno stimolo infiammatorio, ci ha spinto a esplorare se nel promotore del gene di tale enzima fosse presente la sequenza nucleotidica per NF-kB. Al tale scopo è stata analizzata la sequenza del promotore di CYP11A1 ed è stata effettuata una analisi in silico finalizzata ad individuare il sito di legame non solo per NF-kB, bensì per altri fattori di trascrizione che sono stati implicati nella modulazione della neuroinfiammazione.
Propedeutica è stata l’indagine volta alla produzione di informazioni generali riguardanti il gene e il promotore di CYP11A1. Questo gene è localizzato nel cromosoma 15 (Locus: 15q24.1) e il suo promotore prossimale ha una lunghezza di 2402 paia basi in particolare va da - 74 369 998 bp a 74 367 596 bp. (fonti: Eukaryotic Promoter Database).
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Figura 3.14 Visualizzazione del promotore del gene CYP11A1 (EPD: Eukaryotic Protein Database). I coni verdi e rossi rappresentati sono zone dove si legano enzimi metilanti gli istoni, queste corrispondono a zone nelle quali è molto probabile trovare sequenze che legano fattori di trascrizione
L’esperimento consiste nel condurre una analisi “Transcription Factor Binding Prediction”, ossia un’analisi performata mediante apposito programma condotta al fine di individuare i fattori di trascrizione che si legano con maggiore affinità a diversi siti di legame presenti nella sequenza del promotore di CYP11A1. In particolare è stata fatta un’indagine su quelli che sono i fattori di trascrizione in grado di avere una certa affinità, ma che al contempo siano attivati dal processo infiammatorio e preferibilmente nel pathway attivato da IL-1β, come nel caso del fattore NF-kB. Oltre
alla ricerca di questo specifico fattore si sono analizzati tutti quei fattori che cooperino con NF-kB stesso, oppure che siano coinvolti più in generale nell’infiammazione.
SEQUENZA PROMOTORE ottenuta da: “Eukaryotic Promoter Database” ANALISI TF: “TRAP.molgen” (Transfac)
Il sito consiglia di analizzare regioni non più grandi di 4000 bp perché altrimenti la significatività diventa poco attendibile.
I seguenti risultati rappresentano i fattori di trascrizione che hanno maggiore probabilità di legarsi in sequenze specifiche del promotore ordinati secondo il proprio p-value. Ogni specifico fattore di trascrizione può essere presente nella lista anche più di una volta sottoforma di un’altra matrice.
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-2400bp -> 20bp:
Per prima cosa è stata eseguita l’analisi della sequenza che va da –2400 a 20 bp nel promotore:
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Figura 3.15 Visualizzazione dei fattori di trascrizione (ognuno rappresentato da una propria matrice) che hanno affinità per sequenze specifiche del promotore ordinati secondo il loro p- value. Quest’analisi è stata condotta immettendo nel programma trap.molgen la sequenza da -2400 a 20 bp
Nel promotore non sono presenti sequenze che possono essere riconosciute specificamente da NF-kB stesso e, nonostante la maggior parte dei fattori elencati risultano legati allo sviluppo embrionale, al ciclo cellulare e alla differenziazione in generale, alcuni sono interessanti per il loro coinvolgimento con NF-kB e soprattutto con l’infiammazione in generale. Tra questi ritroviamo i fattori di trascrizione RORA, AP1, STAT5A e STAT5B.
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AP-1 (Activator Protein 1)
Nel promotore di CYP11A1, ci sono tre matrici di AP-1 che risultano significative: ▪ AP1_Q2 [p=0,0185], lega a -700bp una sequenza di 11bp, weight score di 9; ▪ AP1_Q2_01 [p=0,0298], lega a -700bp una sequenza di 17bp, weight score di
8;
▪ AP1_Q4 [p=0,0438], sono sequenze che legano in fondo al promotore – 2300bp.
A livello strutturale è un eterodimero composto da proteine appartenenti alle famiglie di c-Fos, c-Jun, ADP e JDP. AP-1 è parso un fattore interessante da analizzare perché esso, insieme NF-kB e STAT3 è coinvolto in meccanismi alla base dell’infiammazione. Oltre a questo ruolo esso è implicato nella regolazione di geni chiave dei pathway oncogenici come nell’angiogenesi, apoptosi, migrazione cellulare e nella transizione epiteliale-mesenchimale (Ji et al.,2018).
STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5)
Esso rappresenta la famiglia dei fattori di trascrizione STAT5 nella quale ritroviamo STAT5A e STAT5B, per ognuno è presente una matrice:
▪ STAT5A_01 [p=0,0287], lega a -400/-500 bp sequenze di 15 bp, weight score di 9;
▪ STAT5B_01 [p=0,0483], lega a -500bp, sequenza di 15bp, weight score di 10. Questi fattori in risposta alle citochine e ai fattori di crescita sono fosforilati dalle chinasi associate al recettore, e quindi formano omo- o eterodimeri che si trasferiscono al nucleo cellulare dove agiscono come attivatori della trascrizione. Ciò che è interessante è come la famiglia STAT collabori con altri fattori di trascrizione, come la famiglia delle proteine RUNX, p53 e soprattutto NF-kB (Loh et al., 2019), il fattore per cui abbiamo più interesse dal punto di vista dello sviluppo del processo neuroinfiammatorio.
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RORA (Related Orphan Receptor A)
Nel promotore di CYP11A1, conducendo la ricerca su 2400 bp, troviamo tre matrici per RORA:
▪ RORA2_01 [p=0,0047], lega a –600 bp sequenze di 13 bp, weight score di 11,7;
▪ RORA1_01 [p=0,0313], lega a -600 bp sequenze di 13 bp, weight score di 9,7; ▪ RORA_Q4 [p=0,0481], lega a –600 bp sequenze di 11 bp, weight score di 9,0.
É un recettore nucleare che lega il DNA come monomero a livello del ROR response element (RORE). Questo fattore è un regolatore dello sviluppo embrionale, della differenziazione cellulare, dell’immunità, del ritmo circadiano e del metabolismo di lipidi, steroidi, xenobiotici e glucosio. Si ritiene che esso abbia un’attività trascrizionale intrinseca che è aumentata da ligandi naturali come gli ossisteroli che agiscono da agonisti (25-idrossicolesterolo), mentre è diminuita da agonisti inversi (steroli ossigenati in posizione 7). In aggiunta, è riconosciuto il suo ruolo nella regolazione dei processi infiammatori sia in condizioni fisiologiche che patologiche, come nella sclerosi multipla. In uno studio (Han et al.,2019) l’induzione della sovraespressione di questo fattore ha portato alla modulazione negativa dell’infiammazione indotta da LPS e all’alleviamento delle lesioni d’organo. Perciò è stato ipotizzato che RORA possa andare a regolare negativamente l’infiammazione diminuendo la traslocazione nucleare di NF-kB p65 e l’acetilazione di p65 e promuovendo l’espressione di una proteina chiamata SIRT1. Quindi esistono evidenze in letteratura che questo fattore di trascrizione RORA sia implicato nella regolazione del processo infiammatorio ed è per questo che è sembrato interessante dal punto di vista di un suo possibile ruolo nella regolazione di CYP11A1 in condizioni infiammatorie.
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-1000 -> 20 bp
Una volta analizzati i fattori di trascrizione che avessero affinità per sequenze nelle 2400 paia basi, quindi in tutto il promotore, è stato operato un restringimento del campo di analisi, utilizzando trap.molgen per la ricerca dei fattori solamente nelle prime 1000 bp a partire dal gene. In questo modo alcuni fattori di trascrizione potrebbero risultare più significativi.
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Figura 3.16 Visualizzazione dei fattori di trascrizione in ordine di p value che riusltano avere sequenze alle quali hanno una certa affinità tra le prime 1000bp del promotore di CYP11A1 Tra questi, oltre alle matrici per quelli citati precedentemente, troviamo altri due fattori interessanti: PPARG e Nur77.
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PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma)
Nella ricerca dei fattori di trascrizione nelle prime 1000 bp del promotore di CYP11A1 troviamo due matrici per questo fattore:
▪ PPARG_Q6 [p=0,0157] sono riconosciute diverse sequenze che possono essere legate da questo fattore. Hanno un weight score tra 6 e 7 ma in genere le sequenze sono corte (7bp). Solo un sito di riconoscimento ha una lunghezza di 13 bp e si trova a –1000 bp ma ha un weight score di 5, valore piuttosto basso;
▪ PPARG_01 [p=0.02224] riconosce una sequenza di 21 bp intorno a –600 bp, ma sempre con un weight score di 5.
Dei fattori appartenenti alla classe PPAR sono presenti diverse isoforme ma la gamma sembra essere quella maggiormente coinvolta nelle risposte infiammatorie. In particolare, l’attività di PPARγ sembra promuovere un fenotipo M2 nei macrofagi e regolare la risposta la risposta infiammatoria nella microglia tanto che si sono studi con agonisti di questo fattore (Bernardo et al., 2006).
Nur77 o NGF1B (Nerve Growth Factor I B) o NR4A1
Per questo fattore è stata trovata unicamente una matrice:
▪ NUR77_Q5 [p=0,0249] esse riconosce solo sequenza piuttosto corte, al massimo di 10 bp. La sequenza più significativa è a –400 bp e presenta un weight score di 9.
L’attivazione di questo fattore è ritenuta essere mediata da NF-kB. Esistono dati in letteratura che dimostrano una sua attività nella regolazione della polarizzazione M1/M2 della microglia. Esso inoltre è coinvolto nella regolazione della steroidogenesi nei tessuti periferici (Zhang et al., 2019).
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Oltre all’analisi dei fattori possibili per le prime 1000 bp, è stata condotta un’ulteriore ricerca nelle restanti 1400 (da –2400 a –1000 bp) ma non è stato trovato alcun fattore di trascrizione interessante che non sia già stato citato precedentemente.
Sarebbe interessante, ai fini di dimostrare un possibile ruolo di questi fattori nella regolazione dell’espressione di CYP11A1 nella microglia infiammata, andare a trattare le cellule in questione (cellule C20 e HMC3) con gli inibitori specifici per ognuno di questi. Da qui si andrebbe poi a quantificare l’espressione del CYP11A1 e in base ai dati stabilire quanto l’espressione dell’enzima sia alterata inibendo l’attività specifica dei fattori di trascrizione in questione. Per ognuno di questi sono stati rintracciati in letteratura gli inibitori più spesso utilizzati:
▪ desametasone per NF-kB; ▪ SR335 per RORA;
▪ Cytosporone (agonista) per Nur77;
▪ GW9662 per PPARγ;
▪ SR11302 per AP-1.
Trattando le cellule microgliali con questi inibitori, se questi fattori dovessero essere implicati nella regolazione positiva dell’espressione di CYP11A1 i livelli dello stesso dovrebbero diminuire.
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