Western Blot di StAR, TSPO e CYP11A1

La tecnica del Western Blot permette l’identificazione di una proteina specifica all’interno di una miscela, tramite l’interazione di legame specifica con l’anticorpo designato. Nel caso di questo progetto, l’analisi tramite Western Blot è stata svolta per valutare l’espressione delle seguenti proteine:

• StAR (sia forma 37kDa che forma 30 kDa) nelle cellule C20, HMC3 e U87MG in condizioni resting (espressione basale),

• StAR (in entrambe le forme), TSPO e CYP11A1 in C20 KD (knockout TSPO) e C20 SCR (scramble, controllo per C20 KD TSPO);

• StAR (in entrambe le forme), TSPO e CYP11A1 in C20 a distanza di 0, 2, 4 e 24 ore dal trattamento con IL-1β.

Il protocollo utilizzato, descritto qui di seguito, è lo stesso per tutte: ciò che cambia è la linea cellulare, l’eventuale trattamento e l’anticorpo utilizzato a seconda della proteina ricercata.

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Per ogni linea cellulare impiegata si dispone la semina di due piastre Petri tipo P100 con 800.00 cellule in 5 mL di mezzo completo. Queste vengono riposte per 24 ore all’interno di un incubatore per consentire alle cellule di aderire completamente alla piastra. Dopo questo periodo di tempo, il mezzo completo è stato sostituito con il mezzo per “starvation” e unicamente nelle cellule in cui si sperimenta la condizione infiammata, è stato somministrato il trattamento con IL-1β a concentrazione 20 ng/mL. Si è quindi proceduto ad una nuova incubazione sempre per 24 ore in condizioni di temperatura pari a 37°C e di atmosfera a 5% CO2. Per la condizione infiammata sono stati valutati i livelli di TSPO, CYP11A1 e StAR solo per le cellule C20 ai tempi di 0, 2, 4 e 24 ore dal trattamento, utilizzando come controllo le cellule condizionate con solo mezzo per starvation senza interleuchina.

In seguito al trattamento desiderato, si è proceduto alla fase di preparazione del campione. Il mezzo di coltura è stato aspirato e sono stati aggiunti circa 3 mL di tampone fosfato salino (PBS). Le cellule sono state successivamente staccate andando a rompere meccanicamente l’adesione con uno strumento apposito denominato scraper. Questa procedura viene eseguita in ghiaccio ed è stata ripetuta per due volte per ricavare una sospensione cellulare con un volume finale di circa 6 mL. Questa è stata sottoposta a centrifugazione ad una temperatura di 4°C per 5 minuti a 90 xg e in seguito, dopo aver aspirato il surnatante, è stato ottenuto il pellet cellulare da mantenere in cella frigorifera a -80°C fino al suo effettivo utilizzo. Nel procedere, è stato riportato a temperatura ambiente e quindi sospeso in 200 µL di tampone RIPA (Sodio deossicolato e SDS 20% in PBS a pH 7,4 con detergente IGEPAL) addizionato di inibitori delle proteasi (Aprotinina, Ortovanadato, PMSF) e delle fosfatasi (NaF). Questo tampone contiene detergenti in grado di distruggere le membrane delle cellule e permettere la fuoriuscita del loro contenuto: la necessità degli inibitori delle proteasi si fa presente considerando che le proteine liberate andrebbero incontro a degradazione enzimatica. La sospensione ottenuta è stata sottoposta ad un processo di sonicazione ad ultrasuoni 15 secondi per tre volte in ghiaccio: l’emissione degli ultrasuoni dal sonicatore è in grado di mettere in vibrazione le strutture cellulari andando a provocarne la rottura. Si è proceduto con l’incubazione del campione per due ore su un supporto rotante alla temperatura di 4°C e dopodiché con la centrifugazione a 13000 g per 15 minuti sempre alla stessa temperatura. Finito ciò si è raccolto il surnatante su

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cui è stata eseguita la procedura della quantificazione del materiale proteico tramite dosaggio spettrofotometrico utilizzando il saggio A+B (DC Protein assay kit, Bio- Rad®). Questo kit contiene tre reagenti: A (soluzione alcalina di tartrato di rame), B (reattivo di Folin-Ciocalteu) ed S (soluzione di surfactanti in grado di attivare la soluzione A). Il saggio si basa sul principio del metodo di Lowry ossia sulla formazione di complessi proteine-rame in grado di portare alla riduzione degli acidi fosfomolibdico e fosfotungstinico (presenti nel reattivo di Folin-Ciocalteu) a complessi di colore blu in grado di assorbire radiazioni a lunghezza d’onda di 750 nm. Prima di tutto viene allestita la soluzione A* aggiungendo il 5% di soluzione S alla soluzione A. Nella realizzazione del saggio è stata utilizzata una piastra da 96 pozzetti nella quale, per ognuno di questi è stato caricato: 5 µL di campione, 25 µL soluzione A*, 200 µL soluzione B (fotosensibile, quindi aggiunta in assenza di luce diretta). Nel bianco il volume di 5 µL di campione è stato sostituito con la stessa quantità di tampone RIPA+inibitori. Una volta preparati i pozzetti si è proceduto con un’incubazione al buio per 15 minuti e, al fine di questa è stata eseguita la lettura allo spettrofotometro utilizzando una lunghezza d’onda pari a 750 nm; i valori d’assorbanza forniti dallo strumento sono serviti al calcolo delle concentrazioni totali del campione di partenza. Dalle concentrazioni sono stati ricavati i volumi necessari per avere una certa quantità di proteina (30-50 µg), questi sono stati utilizzati per la preparazione delle mix insieme all’aggiunta della soluzione di Laemmli per un volume finale massimo di 20-25 µL. La soluzione di Laemmli contenente sodio dodecil solfato (SDS), β-Mercaptoetanolo e blu di bromofenolo, è necessaria per procedere all’elettroforesi su gel di poliacrilammide delle proteine in condizioni denaturanti (SDS-PAGE). L’indicatore del fronte della corsa è rappresentato dal blu di bromofenolo. La tecnica dell’elettroforesi su gel di poliacrilammide consente la separazione di proteine, che migrano grazie all’applicazione di un campo elettrico, all’interno di un gel poroso in grado di trattenerle più o meno a seconda delle loro dimensioni. La carica negativa alle proteine è conferita dal legame con l’SDS, che porta loro a migrare verso l’anodo (polo positivo). Prima di procedere alla fase di caricamento, i campioni sono stati bolliti per un tempo di 5 minuti e successivamente posti in ghiaccio per provocare uno shock termico. E’stata quindi preparata la camera di corsa contenente una soluzione tampone (running buffer), composto da TRIS

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(Trizma), SDS e glicina ad un pH di 6,8 e all’interno di essa è stato immerso un supporto contenente un gel di poliacrilammide avente una percentuale di polimerizzazione in gradiente 4% - 20% (Midi-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Precast Gels, Bio-Rad®). In seguito, i campioni e lo standard sono stati caricati nei pozzetti collocati nella porzione superiore del gel (stacking gel). Lo standard è una soluzione contenente frammenti proteici a vario peso molecolare da prendere come riferimento per la determinazione dei pesi molecolari della proteina ricercata. Il range di PM utilizzati per lo standard in questo lavoro va da 10 a 200 kDa (Prestained SDS-PAGE Standards #1610318 Bio-Rad®), precedentemente diluito con la soluzione di Laemmli. Una volta finito il caricamento del tutto, la camera è stata collegata a un apparecchio in grado di fornire la corrente ai due elettrodi per la generazione di una differenza di potenziale tra essi, e permettere quindi la migrazione delle proteine nei campioni. All’avvio della corsa si è utilizzato un amperaggio basso e un voltaggio costante per consentire l’entrata dei campioni nel running gel, ossia la porzione di gel deputata alla corsa. Avvenuto ciò si è proceduto con l’aumento dell’amperaggio al fine di consentire l’accelerazione della corsa, la quale procede fino a che il fronte non raggiunge il fondo della camera: si ottiene così la graduale separazione delle proteine secondo il loro peso molecolare. Prima di procedere alla visualizzazione delle proteine il gel è stato sottoposto alla procedura di attivazione tramite ChemiDoc (ChemiDoc XRS+ System Bio-Rad®). Essendo un gel di tipo “Stain Free” l’attivazione è necessaria poiché il trialocomposto incorporato nel gel, esposto alle radiazioni UV del Chemidoc, si lega covalentemente ai residui di triptofano presenti nelle proteine: è la formazione di questi legami che permette di visualizzare le proteine in chemiluminescenza.

Per immobilizzare e allo stesso tempo rendere accessibili le proteine alla rilevazione dell’anticorpo, si è proceduto con il trasferimento di queste dal gel ad una membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF). Il metodo utilizzato per fare ciò è l’“electroblotting”: grazie all’applicazione di una differenza di potenziale, il campo elettrico generato consente alle proteine di trasferirsi dal gel alla membrana stabilendo delle interazioni elettrostatiche con questa. Il gel contenente le proteine precedentemente separate per elettroforesi, è stato adagiato sopra la membrana di PVDF e carta da filtro imbevuta di transfer buffer. Successivamente, anche il gel è stato ricoperto con carta da filtro e il

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sistema così formato è stato chiuso con un coperchio contenente il catodo (polo negativo) dalla parte del gel e l’anodo (polo positivo) dalla parte della membrana. Il tutto è stato quindi sottoposto a una differenza di potenziale tramite apposito strumento per permettere il trasferimento delle proteine. Finito il trasferimento, si è utilizzato il Chemidoc per visualizzare e ottenere il valore di quantità densitometrica delle proteine totali caricate effettivamente in ogni pozzetto. Questo parametro viene chiamato “Total protein” ed è necessario per normalizzare il dato finale dell’intensità di banda della proteina identificata tramite anticorpo sul numero di proteine totali, così da visualizzare come l’espressione delle proteine ricercate vari in seguito ai trattamenti eseguiti.

Dato che l’anticorpo potrebbe dare interazioni aspecifiche, si è proceduto con il blocco di tutti i siti presenti nella membrana ottenuto ponendo questa per 2 ore in un volume pari a 20 mL di soluzione di blocking. Si utilizza una soluzione con composizione diversa a seconda dell’anticorpo:

• per TSPO, latte in polvere al 5% (Nonfat dry milk, Bio-Rad®) in TBS-T (Tampone Tris, NaCl, pH 7.4, aggiunta di detergente Tween20)

• per CYP11A1 e StAR è una soluzione di albumina sierica bovina (BSA) al 5% in TBS, addizionato dello 0,1% di Tween20 (detergente).

Al fine delle due ore di blocking, si è proceduto con l’aggiunta di 20 mL della soluzione contenente una diluizione di anticorpo primario nella rispettiva blocking. Le diluizioni e gli anticorpi utilizzati sono riportati di seguito:

• per TSPO sono state utilizzate immunoglobuline G (IgG) policlonali di coniglio diluite 1:7500 in milk 5%, fornite dal gruppo di ricerca coordinato dal professor Wetzel CH. dell’Università di Regensburg;

• per CYP11A1 è stato utilizzato l’anticorpo primario D8F4F Rabbit mAb Cell Signaling®, costituito sempre da IgG di coniglio, diluito 1:500 in BSA 5%; • per StAR è stato utilizzato l’anticorpo primario D10H12 Rabbit mAb Cell

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Finita l’ora d’incubazione, sono stati eseguiti tre lavaggi da 5 minuti l’uno con tampone TBS-Tween. Si è proceduto con l’incubazione per 2 ore della membrana con la soluzione di anticorpo secondario, Anti-Rabbit (Rabbit IgG F(ab′)2 fragment Sigma Aldrich®) diluito 1:5000 con soluzione di milk al 5%. Le incubazioni sono state condotte a temperatura ambiente. Una volta trascorse le due ore sono stati condotti tre lavaggi da 10 minuti l’uno, sempre in TBS-Tween. Prima di andare a visualizzare le proteine la membrana viene mantenuta idratata tenendola in TBS.

Procedendo quindi con la fase di sviluppo, la membrana è stata ricoperta con una miscela delle soluzioni contenti luminolo e H2O2 fornite dal kit (Clarity Western ECL

Substrate, Bio-Rad®) e si è incubata per cinque minuti al buio. Il luminolo in presenza di perossido d’idrogeno è in grado di comportarsi da substrato per l’enzima HRP (perossidasi di rafano) coniugata all’anticorpo secondario, legato a sua volta all’anticorpo primario. Così l’ossidazione del luminolo porta alla produzione di una radiazione luminosa misurabile tramite una delle funzioni integrate nel Chemidoc: ciò permette la rilevazione di bande scure corrispondenti alla proteina ricercata. Ottenute le immagini viene condotta l’analisi colorimetrica che permette di rilevare la scala di bande data dal marker a peso molecolare noto. L’attenzione è stata rivolta alle bande intorno ai 20 kDa per TSPO, intorno ai 50 kDa per CYP11A1 e intorno a 30 e 37kDa per le due forme della proteina StAR. In seguito è stata eseguita la normalizzazione delle immagini ottenute rispetto al “Total protein”.

2.4 Real Time RT-PCR dei geni codificanti gli enzimi della

cascata steroidogenica

La Real Time PCR, derivante dalla classica Polymerase Chain Reaction (PCR), è una tecnica che permette l’amplificazione selettiva in vitro di una sequenza target di DNA grazie all’allestimento di condizioni che portano a riprodurre la reazione condotta dall’enzima DNA polimerasi in ogni singola cellula vivente. Ciò che distingue questa tecnica è che oltre all’amplificazione della sequenza specifica, è possibile eseguire la

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quantificazione della stessa. Ciò è possibile grazie a dei particolari composti che, aggiunti alla miscela di reazione sono in grado di emettere un segnale di fluorescenza ad ogni ciclo di reazione proporzionale alla quantità di amplificato. Questo è particolarmente importante per lo studio dell’espressione di particolari geni d’interesse. Inoltre, come templato della reazione di RT-PCR viene utilizzato del DNA detto DNA copia (cDNA) derivante dalla retrotrascrizione dell’mRNA in DNA. Il gene la cui espressione deve essere analizzata, viene specificatamente riconosciuta grazie a delle piccole sequenze nucleotidiche chiamate primers. I primers sono brevi sequenze di DNA complementari alle estremità 5’ (Forward, Fw) e 3’ (Reverse, Rv) di una porzione del gene in esame: esse fungono da innesco per la reazione di amplificazione.

Nella miscela di reazione sono quindi presenti: cDNA, sonda intercalante (in questo caso SYBR GREEN), primer forward e reverse, e buffer di reazione contenente principalmente ioni Mg2+ e i dNTPs (deossinucleosidi trifosfato). La sonda intercalante SYBR GREEN è una molecola fluorescente in grado di dare interazione aspecifiche a livello del solco minore di ogni DNA a doppio filamento.

In questo progetto sono stati utilizzati i primer per i geni codificanti la maggior parte degli enzimi coinvolti nella steroidogenesi come visibile nella Figura 2.1.

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Figura 2.1: Tabella che elenca i primers Forward e Reverse specifici utilizzati per ogni enzima della cascata, loro zona di amplificazione e lunghezza dell’amplificato.

In più vanno considerati i primers per il gene della β-actina FOR: 5′-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′

REV: 5′-GAGCCGCCGATCCACACG-3′

Essendo questo un gene “housekeeping”, ossia costitutivamente espresso, la sua analisi è necessaria per confrontare l’espressione del gene ricercato, dal momento che il gene della β-actina è sempre espresso in tutte le cellule in quantità elevate.

La Real Time PCR viene allestita su piastre apposite contenenti 48/96 pozzetti (Biorad® Multiplate PCR Plates Low 48-Well White) e in ogni pozzetto vengono caricati per un volume finale di 20 µL:

• 1 µL (contenente 50 ng di cDNA) di soluzione DNA; • 1 µL di primer Fw;

• 1 µL di primer Rv; • 10 µL di SYBR GREEN; • 7 µL di H2O DEPC.

Una volta che sono stati caricati i pozzetti con i componenti necessari, la piastra viene inserita in un termociclatore (MJ Mini Personal Thermal Cycler Biorad®) tramite il quale i campioni sono sottoposti ad un protocollo termico ciclico idoneo. Questo

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protocollo rispecchia le tre fasi di cui si compone la reazione di polimerizzazione del DNA:

1. Denaturazione: apertura della doppia elica di DNA,

2. Annealing: i primers si appaiano tramite interazioni alle sequenze complementari presenti nel DNA del campione specifico,

3. Allungamento: l’enzima DNA polimerasi porta alla formazione dei filamenti complementari allungando così gradualmente la catena.

Queste fasi vengono ripetute tra le 30 e le 40 volte dipendentemente dal protocollo in uso e, al termine di ogni ciclo di elongazione la molecola intercalante (SYBR GREEN) forma un legame con il dsDNA provocando un’emissione di fluorescenza a lunghezza d’ onda di 529 nm. L’intensità di questa risulta proporzionale alla quantità di DNA amplificato e viene registrata ad ogni ciclo e trasformata in grafico rappresentante una curva ad andamento esponenziale. I parametri fondamentali da analizzare sono il Ct (Cycle threshold) e la curva di melting: il primo indica il numero di cicli necessari per raggiungere la soglia (threshold) oltre la quale inizia la fase esponenziale della curva e quindi più il gene è espresso minore è il valore di Ct perché saranno necessari meno cicli di amplificazione, mentre il secondo permette di stabilire se la fase di amplificazione è avvenuta correttamente fornendo un’indicazione della purezza del prodotto di reazione e rivelando la presenza di dimeri degli inneschi.

Fino a qui è stata descritta in generale la tecnica della Real Time PCR e il suo scopo ma prima di arrivare a tale analisi sono stati eseguiti i seguenti passaggi:

1) Ottenimento del campione;

2) Estrazione dell’RNA dalle cellule del campione; 3) Retrotrascrizione dell’RNA estratto in cDNA; 4) Real Time PCR.

L’analisi è stata condotta su entrambe le linee cellulari di microglia, C20 e HMC3, e sulla linea tumorale modello di astrociti U87MG. I campioni di partenza sono stati ottenuti in seguito alla semina delle cellule C20 e HMC3 in multiwell da sei contenenti 200.000 cellule per pozzetto e applicando il protocollo di infiammazione sopra descritto.

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Le cellule sono state quindi staccate dall’adesione mediante l’utilizzo di Tripsina, successivamente la sospensione ottenuta è stata centrifugata a 4°C per 5 minuti. Il pellet cellulare è stato conservato a -80 °C in cella frigorifera fino al momento dell’utilizzo.

Una volta ottenuti i campioni da utilizzare si è proceduto con l’estrazione dell’RNA: questa è stata condotta utilizzando il set RNeasy Micro Kit di Qiagen® comprendente i reagenti e i materiali necessari all’operazione. Il principio su cui si basa la tecnica di estrazione dell’RNA è la precipitazione etanolica degli acidi nucleici con successiva purificazione dell’RNA tramite l’utilizzo di colonnine presenti nel kit.

Prima di procedere con l’estrazione, sono state preparate le soluzioni di Etanolo al 70% e di Buffer RLT (presente nel kit) con aggiunta di 10 μL/mL di β- Mercaptoetanolo in volumi tali da poter trattare ogni campione.

Successivamente si procede secondo il protocollo di seguito:

1. aggiunta ad ogni campione di 600 µL di buffer RLT+β-Mercaptoetanolo e agitazione tramite vortex per 1 minuto al fine di consentire la rottura delle membrane cellulari e così portare alla fuoriuscita del contenuto cellulare; 2. aggiunta di 600 µL di etanolo al 70% come lavaggio;

3. trasferimento di 600 µL della soluzione in colonnine dotate di un filtro inserite in un tubo raccoglitore (la colonnina possiede una resina a scambio ionico in grado di legare l’RNA);

4. centrifugazione delle vials per 30 secondi a 10000 rpm e scarto del residuo; 5. trasferimento della restante quantità dei campioni in colonna con successiva

centrifugazione delle vials per 30 secondi a 10000 rpm e scarto del residuo; 6. aggiunta di 700 µL di buffer RW1 in colonna e centrifugazione per 30 secondi

a 10000 rpm. Lo scarto eliminato contiene zuccheri, proteine e lipidi mentre gli acidi nucleici restano legati al filtro della colonna;

7. aggiunta di 500 µL di buffer RPE e centrifugazione per 2 minuti a 10000 rpm con successivo scarto del residuo;

8. ulteriore centrifugazione per 2 minuti a 10000 rpm con successivo scarto del residuo;

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9. sostituzione del tubo raccoglitore con una eppendorf da 1,5 mL per raccogliere l’RNA;

10. aggiunta di 30 µL di H2O RNAsi-free e centrifugazione per 1 minuto a 10000

rpm;

11. eliminazione della colonnina. L’RNA estratto è ora nella eppendorf.

Una volta finita l’estrazione dell’RNA è necessario procedere alla determinazione della sua concentrazione e purezza, ciò è possibile utilizzando lo spettrofotometro Thermo Scientific™ NanoDrop Lite. Si pone quindi un volume di 1,5 µL di campione sul sensore dello strumento il quale, tramite la misura dell’assorbanza a 280 nm fornisce le misure della concentrazione in ng/µL e il grado di purezza sottoforma di rapporto tra l’assorbanza a 260 nm (lunghezza d’onda ottimale per la misurazione di questo parametro nelle proteine) e l’assorbanza a 280 nm. Per poter considerare un campione puro questo rapporto deve avere un valore compreso tra 1,8 e 2,0.

Ogni campione di RNA è stato sottoposto a reazione di retrotrascrizione al fine di ottenere il DNA complementare a doppio filamento (cDNA) da analizzare poi con la Real Time PCR. Per la retrotrascrizione è stato utilizzato il kit iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad®) composto da:

• Enzima retrotrascrittasi, che sintetizza il filamento di DNA complementare all’RNA;

• Mix di reazione contenente deossiribonucleotiditrifosfato (dNTP), magnesio, una miscela di sequenze di DNA oligo(dT) che fungono da primer, Rnasi H (necessaria ad eliminare l’RNA residuo);

• Acqua nucleasi free.

La reazione di retrotrascrizione è stata condotta in eppendorf da 0,2 mL partendo da 500 ng di RNA ai quali sono stati addizionati 1 µL di enzima RT, 4 µL di reaction mix e acqua RNAsi-free per raggiungere il volume totale di 20 μL.

Le provette eppendorf sono state riposte in un termociclatore (MyCycler, Bio-Rad®), strumento in grado di sottoporre i campioni ai diversi cicli di riscaldamento o raffreddamento programmati per far avvenire la reazione. Il procedimento è diviso in vari step: il primo (priming) prevede il mantenimento di una temperatura di 25 °C per

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5 minuti, il secondo (retrotrascrizione) prevede il riscaldamento a 46°C per un tempo di 20 minuti ed il terzo un ulteriore riscaldamento a 95°C per disattivare la retrotrascrittasi. Una volta terminato il procedimento, i campioni vengono mantenuti a 4°C se l’analisi di Real Time PCR viene condotta subito dopo, oppure vengono conservati a -20°C fino al loro utilizzo. Il cDNA retrotrascritto è ora pronto per essere amplificato ed analizzato. Si procede quindi con il caricamento della piastra (Multiplate PCR Plates Low 48-Well White Bio-rad®). In ogni pozzetto vengono inseriti tutti i reagenti necessari al corretto svolgimento della reazione:

• 10 µL SYBR GREEN

• 1 µL primer Reverse (10µM) • 1 µL primer Forward (10µM) • 1 µL (25 ng) cDNA

• 7 µL H2O per raggiungere un volume finale di 20 uL

Per ogni campione vengono preparati due pozzetti per avere risultati più attendibili e tutte le operazioni di caricamento sono state eseguite in ghiaccio in modo da evitare il più possibile l’accoppiamento dei primer, fenomeno che è in grado di realizzarsi più facilmente a temperatura ambiente.

Una volta avvenuto il caricamento di tutti i campioni, la piastra viene posta nel termociclatore (CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System; Bio-Rad®) e viene impostato il protocollo a seconda del gene in analisi. La temperatura di annealing