Colture cellulari

Gli esperimenti svolti per la realizzazione di questa tesi sono stati condotti su due linee cellulari di microglia umana immortalizzata: HMC3 di origine embrionale e C20, derivante da microglia adulta. Gran parte dei risultati ottenuti per le prime due linee cellulari sono stati messi a confronto con i corrispettivi calcolati per le cellule U87MG, modello astrocitico in vitro di glioblastoma.

Ogni procedura che prevede l’utilizzo di cellule vive necessita materiale sterile e condizioni tali da mantenere la sterilità dell’ambiente in cui vengono eseguite. Ciò è stato ottenuto conducendo le operazioni su cellule in coltura sotto cappa a flusso, in grado di garantire tramite filtri HEPA (High Efficiency Air Particulate filter) un flusso laminare verticale di aria sterile. Le linee cellulari utilizzate crescono in adesione e sono state coltivate all’interno di adeguati supporti, denominati fiasche o T75, con superficie di 75 cm2 e dotate di tappo filtrante per consentire lo scambio gassoso, mantenendo comunque la sterilità.

Le condizioni necessarie alla crescita cellulare sono rappresentate da una temperatura di 37°C e una percentuale di anidride carbonica del 5%, tali condizioni sono provviste dall’incubatore dove sono riposte le fiasche.

Per il mantenimento delle colture cellulari è necessario un mezzo di colture adeguato a fornire i nutrienti di cui hanno bisogno le cellule e nel quale possano essere eseguiti gli eventuali trattamenti provvisti dai protocolli sperimentali. Nel mezzo di coltura completo sono generalmente presenti in soluzione: glucosio e altri zuccheri, vitamine, amminoacidi, sali minerali, ormoni e fattori di crescita. Questi permettono di creare un ambiente il più possibile vicino alle condizioni fisiologiche e che sia in grado di consentire alle cellule di sopravvivere.

Le cellule C20 di microglia umana adulta sono state generate dal gruppo di ricerca di David Alvarez-Carbonell, Ph.D. (Case Western Reserve University) e sono coltivate nel mezzo DMEM-F12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) con una percentuale del 10% di siero fetale bovino (FBS) e una soluzione contenente penicillina e

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streptomicina (100U/mL). Le cellule immortalizzate (che esprimono l’enzima telomerasi) sono selezionate con l’aggiunta al mezzo di una quantità di Neomicina tale da raggiungere una concentrazione di 600 μg/mL.

La linea cellulare HMC3 è disponibile in commercio come linea di microglia umana fetale immortalizzata; questa è stata coltivata con mezzo EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium, 1,5 g/L di sodio bicarbonato, amminoacidi non essenziali e sodio piruvato), contenente il 10% di FBS e 100 U/mL di soluzione di penicillina e streptomicina.

Per entrambe le linee cellulari, il mezzo è stato filtrato per ridurre al minimo ogni possibilità di contaminazione.

Dopo aver proceduto con la semina delle cellule, queste aderiscono e iniziano a replicarsi andando ad occupare tutto lo spazio a disposizione nella fiasca e consumando tutti i nutrienti disponibili nel mezzo. Una volta che queste arrivano a confluenza, è quindi necessario andarle a staccare dalla fiasca utilizzando una soluzione diluita di tripsina e acido etilendiamminotetracetico (EDTA). Quest’ultimo è infatti in grado di aumentare l’efficacia dell’enzima chelando gli ioni Ca2+ e Mg2+, così da favorire il distacco delle cellule dalla fiasca per permettere la loro successiva divisione in altri supporti per colture cellulari (piastre petri, fiasche).

Nello specifico quest’operazione viene definita “passaggio” e nel complesso prevede: 1. lavaggio del materiale cellulare con buffer salino contenente ioni fosfato; 2. aggiunta della soluzione di Tripsina/EDTA 1X;

3. mantenimento delle cellule a 37°C per 5 minuti (finchè queste non risultano del tutto staccate dalla superficie di adesione);

4. inattivazione della Tripsina mediante aggiunta di mezzo completo;

5. trasferimento della sospensione cellulare in provetta con successiva centrifugazione in centrifuga da banco per 5 minuti a 90 xg in modo da ottenere il pellet cellulare sul fondo;

6. aspirazione del surnatante e risospensione del pellet in mezzo completo nuovo. Prima della semina è stata eseguita la conta cellulare mediante cell counter automatico (Scepter™, Merck®). Innanzitutto si è prelevata un’aliquota di sospensione e diluita

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con mezzo completo in vial da 1,5 mL. Il cell counter mediante un sensore capillare è in grado di prelevare un volume preciso di sospensione dalla vial: con lo scorrimento delle cellule attraverso l’apertura del sensore, la resistenza aumenta e ciò si traduce in un innalzamento della tensione che viene registrata come picco al passaggio di ogni singola cellula. Questi picchi risultanti sono raggruppati in istogrammi e le concentrazioni cellulari sono fornite con unità di misura cellule/mL di sospensione. Una volta eseguita l’operazione di conta cellulare si è proceduta con la semina di un numero di cellule tale da soddisfare le richieste dell’esperimento da eseguire.

Negli esperimenti svolti per il realizzamento di questo progetto sono state utilizzate cellule che abbiano subito dalle 10 fino alle 20 operazioni di passaggio: questo perché, pur essendo cellule immortalizzate, il processo del passaggio potrebbe non garantire la riproducibilità delle condizioni sperimentali e/o compromettere la riuscita ottimale dell’esperimento. Inoltre, nel caso specifico di questo progetto sono adoperate cellule di microglia, molto sensibili ai cambiamenti dell’ambiente di coltura. Per questi motivi è bene non sottoporre le cellule a un numero eccessivo di procedure di passaggio. Inoltre, in alcuni esperimenti, le cellule sono state mantenute per il tempo di 24 ore in mezzo per “starvation” senza siero. Queste condizioni bloccano le cellule nella fase G0 del ciclo cellulare per permettere sia una loro sincronizzazione che una maggiore sensibilità allo stimolo infiammatorio (Davis et al.,2018). Questa operazione è largamente adoperata da molti laboratori di ricerca che lavorano su cellule della glia; tuttavia, già il passaggio da mezzo completo a mezzo per starvation risulta una condizione di possibile stress e pertanto gli effetti dovuto a questo cambiamento devono essere accuratamente valutati.