Valutazione quantitativa del pregnenolone tramite saggio ELISA

La valutazione della produzione di pregnenolone è stata condotta mediante saggio ELISA (Enzyme-Linked Immunoassorbent Assay) di tipo competitivo. Il test ELISA è una tecnica di analisi immunoenzimatica basata sulla specificità d’interazione tra un antigene e un anticorpo che permette di determinare quantitativamente una sostanza all’interno di un campione. In questo caso è stato praticato un test ELISA di tipo competitivo, nel quale è previsto l’utilizzo di piastre, fornite dal kit, provviste di pozzetti con l’anticorpo ancorato sul fondo. La molecola in esame entra in competizione per il sito di legame dell’anticorpo con lo stesso antigene marcato con un enzima aggiunto nell’ambiente di reazione. Dopo un periodo di incubazione, il materiale non legato viene eliminato con i successivi lavaggi e si procede con l’aggiunta di un substrato enzimatico che viene lasciato a reagire per un determinato tempo fino all’aggiunta della soluzione di arresto.

Figura 2.2 Rappresentazione della competizione che si crea per l'anticorpo tra l'antigene nel campione e l'antigene coniugato all'enzima

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Una volta eseguiti questi passaggi, per ogni pozzetto viene misurata l’assorbanza a 450 nm; l’intensità della colorazione è inversamente proporzionale alla quantità di sostanza presente.

All’interno del kit utilizzato sono presenti degli standard utilizzabili per la realizzazione della retta di taratura, necessaria per la quantificazione dei campioni incogniti.

Figura 2.3 Esempio di retta di taratura. Data sheet kit Pregenolone-ELISA (DB52031-IBL® INTERNATIONAL GMGB).

Questo metodo di analisi è stato scelto per l’acquisizione di dati sull’effettiva produzione di pregnenolone nei seguenti casi:

• Cinetica di rilascio di pregnenolone dalle cellule C20 TSPO KD e cellule di controllo (cellule C20 scramble);

• Rilascio di pregnenolone dalle cellule C20 TSPO KD e C20 SCR in seguito a stimolazione farmacologica tramite ligandi di TSPO.

Le cellule sono state seminate in multiwell da 96, seminando in mezzo completo

10.000 cellule per pozzetto e lasciate in incubatore a 37°C e 5% di CO2 per 24 ore. Le

valutazioni della produzione di pregnenolone non vengono eseguite direttamente sul mezzo di coltura perché l’FBS potrebbe contenere pregnenolone. Inoltre, i vari componenti presenti all’interno del mezzo potrebbero interferire con il saggio. Perciò dopo 24h d’incubazione il mezzo completo viene sostituito con mezzo salino, attraverso il quale verranno somministrati i vari trattamenti quando previsti.

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Composizione del mezzo salino:

• Mezzo salino A: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, MgSO4 1mM,

glucosio 10 mM, HEPES 10 mM e portato a pH 7,4 con NaOH 0,6 N • Mezzo Salino B: mezzo salino A + BSA 5%

• Mezzo salino C: Mezzo B con l’aggiunta di Trilostano (25uM) e SU-10603 (10uM). Il trilostano blocca l’enzima 3β-HSD che converte il pregnenolone in progesterone, mentre SU-10603 agisce sull’enzima CYP17A1 bloccando la conversione pregnenolone-DHEA. L’aggiunta di queste due sostanze permette di bloccare il metabolismo del pregnenolone, il quale si accumula nel mezzo salino che verrà usato per la quantificazione nel test ELISA. Di seguito sono riportate le strutture.

Per le prove che prevedono trattamento con ligandi (vedi paragrafo 2.2) del TSPO, la soluzione madre dei ligandi è stata diluita a 4 mM in mezzo salino B. Successivamente un volume idoneo di ligando 4mM è stato aggiunto al mezzo C per raggiungere una concentrazione finale di ligando di 40 uM in un volume finale di 60 uL.

Allestimento dei campioni C20 KD e C20 SCR per la valutazione della cinetica della produzione di pregnenolone nel tempo

Di seguito è riportata la procedura adottata per verificare la produzione di steroidi de novo nelle cellule di microglia a livello basale. In questo caso le cellule utilizzate sono C20 knockdown per il gene del TSPO (KD) e il controllo C20 scramble (SCR) per valutare il contributo del TSPO nel mantenimento della capacità steroidogenica de novo.

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Passate le 24h d’incubazione dopo la semina delle cellule, sono state ripetute le seguenti operazioni su due pozzetti per ogni linea dopo 60, 90, 120 e 180 minuti:

• Aspirazione del mezzo di coltura • Lavaggio delicato con mezzo salino A • Aggiunta di 60 µL di soluzione C

Trascorsi centottanta minuti sono state effettuate le operazioni sugli ultimi due pozzetti che rappresentano il controllo dell’esperimento in quanto risultano avere un tempo di incubazione uguale a 0.

Figura 2.4 Schema del protocollo sperimentale utilizzato per le cellule C20 TSPO KD e C20 SCR per la valutazione della cinetica di rilascio del pregnenolone

Al termine del protocollo sperimentale, il surnatante di ogni pozzetto viene recuperato in vials separate, centrifugato a 4°C per 15 minuti a 8000 xg e utilizzato successivamente per il test ELISA. Nel multiwell, le cellule vengono sottoposte a fissaggio e colorazione con cristal violetto, come descritto nel paragrafo 2.7, allo scopo di normalizzare il dato ottenuto dal test ELISA sul numero di cellule presenti.

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Allestimento dei campioni di C20 TSPO KD e C20 SCR per la valutazione della produzione di pregnenolone a livello basale in presenza di ligandi del TSPO

La quantificazione del pregnenolone è stata eseguita anche a livello basale in presenza di ligandi del TSPO per le cellule C20 knockdown TSPO e sul controllo C20 SCR. Come in precedenza, dopo le 24 h di semina, il mezzo è stato aspirato, le cellule sono state lavate con mezzo salino A e trattate con una soluzione contenente 59,4 µL di mezzo salino C e 0,6 µL di soluzione di ligando 4 mM per ottenere la concentrazione finale di ligando pari a 40 µM.

Figura 2.5 Schema del protocollo di trattamento per le cellule in condizioni basali più ligandi del TSPO per la valutazione del rilascio di pregnenolone.

Dopo 2h di incubazione, le cellule e il surnatante sono state processati come descritto per il precedente protocollo sperimentale.

Per il saggio ELISA è stato utilizzato il kit Pregnenolone ELISA DB52031 - Enzyme immunoassay for the direct quantitative determination of Pregnenolone in human serum (IBL® INTERNATIONAL GMGB) contenente:

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• 96 pozzetti coniugati con l’anticorpo Anti-Pregnenolone policlonale di coniglio;

• ENZCONJ CONC: una soluzione di pregnenolone coniugato con la perossidasi di rafano concentrata 50x;

• 6 calibratori A-F: soluzioni di pregnenolone a concentrazione nota riportate nella tabella seguente per la costruzione della retta di taratura;

Figura 2.6 Concentrazioni e volumi delle soluzioni di calibrazione. Data sheet kit Pregnenolone-ELISA

• Soluzioni di controllo LOW e HIGH: soluzioni tampone ottenute tamponando con concentrazioni note di pregnenolone, utilizzate per determinare l’intervallo di valori entro cui effettuare le quantificazioni di campioni incogniti;

• Wash buffer 50x: buffer di lavaggio concentrato;

• Assay buffer: soluzione nella quale viene sciolto il campione;

• TMB SUBS: Soluzione di tetrametilbenzidina (TMB) e perossido d’idrogeno priva di DMSO o DMF, solventi che potrebbero danneggiare i campioni per le loro capacità di solvatazione. Essendo fotosensibile, questa soluzione è da aggiungere in assenza di luce diretta;

• TMB STOP: Soluzione di arresto della reazione costituita da acido solforico 1M.

Procedura del saggio ELISA

1. Preparazione della soluzione diluita 1:50 di ENZCONJ in assay buffer e la soluzione di lavaggio diluita 1:10 in acqua (queste vengono conservate in ghiaccio);

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2. Collocazione dei pozzetti con l’anticorpo sul fondo su un supporto ed aggiunta di 50 µL di ogni calibratore o di campione al loro interno;

3. Aggiunta di 100 µL di soluzione di ENZCONJ in ogni pozzetto;

4. Incubazione della piastra per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker; 5. Lavaggio dei pozzetti per tre volte con 300 µL di buffer di lavaggio per

eliminare ciò che non si è legato;

6. Aggiunta di 150 µL di soluzione di TMB;

7. Incubazione per 10-15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker al buio; 8. Aggiunta di 50 µL di soluzione TMB STOP;

9. Lettura dell’assorbanza a 450 nm al microplate reader entro 20 minuti dall’arresto della reazione.