Dal momento che non esistono dati in letteratura che riportino un “pattern” di espressione per il gene PDGF-B nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale, ho clonato il gene XPDGF-B in pGEM-T, l'ho linearizzato, ed ho trascritto una sonda a RNA antisenso (o probe) utilizzando un mix di ribonucleotidi contenenti l'uridintrifosfato modificata con un legame con la digossigenina (UTP-dig). Questa viene riconosciuta da un anticorpo anti- digossigenina (AB α-dig) complessato con la fosfatasi alcalina, che, tramite opportuno substrato, consente la visualizzazione di dove si sia andata ad ibridare la sonda nell'intero embrione. In questo modo è stato possibile osservare il pattern d'espressione di XPDGF-B a diversi stadi di sviluppo nell'embriogenesi (Figura 2).
Fig. 2: pattern di espressione di XPDGF-B. Esempi di embrioni in visione dorsale o laterale processati per
ibridazione in situ a vari stadi, utilizzando come marcatore xpdgf-b (in blu). In alto a sinistra ed in alto a
destra, l'espressione di xpdgf-b in un embrione a stadio 16, rispettivamente in visione frontale ed in visione
dorsale; in basso a sinistra, l'espressione in un embrione a stadio 21; in basso a destra, l'espressione di un embrione a stadio 24.
Non è ben chiaro dove si localizzi l'espressione di XPDGF-B. Se confrontiamo l'espressione di del gene XPDGF-B con quella di Six 1 (Brugmann et al., 2004 ) che marca quella porzione di ectoderma che darà i placodi (PPE, pre-placodal ectoderm), sembra che l'espressione di XPDGF-B si localizzi proprio in corrispondenza di questa regione, e della porzione più ventrale del futuro tubo neurale. Nell'embrione a stadio 21 vediamo una lieve marcatura in corrispondenza proprio dei placodi, ma anche nei rombomeri, e nel futuro eye field. Quest'ultima si osserva anche a stadi più tardivi (stadio 24) dove XPDGF-B marca la
porzione ventrale della retina.
Fig. 3: Mappa dei territori presuntivi della cresta neurale, della piastra neurale del pre-placodal ectoderm e dell'epidermide in un embrione di Xenopus laevis allo stadio di neurula. In azzurro, il tubo
neurale; in azzurro chiaro, le creste neurali; in verde il pre-placodal ectoderm; in giallo, l'epidermide. Il territorio presuntivo dell'ectoderma che darà i placodi è segnato anche dal segnale del probe di Six 1. Immagine tratta dal lavoro “Six1 promotes a placodal fate within the lateral neurogenic ectoderm by
functioning as both a trascriptional activator and repressor” , Brugmann SA et al., 2004).
Nella neurula, sembra esserci una complementarietà tra il territorio in cui è espresso il recettore PDGFRα ed il ligando PDGF-B in Xenopus laevis (Figura 4).
Fig. 4: pattern d'espressione di PDGFRα e XPDGF-B a confronto in un embrione a stadio 15-16. A
sinistra, visione dorsale di un embrione di Xenopus laevis a stadio 15-16 processato per ISH con il probe
pdgfra (C.J. Bae et al., 2013); a destra, visione dorsale di un embrione di Xenopus laevis a stadio 15-16
Processato per ISH con il probe xpdgfb.
Per poter però affermare con certezza dove si esprima XPDGF-B sono attualmente in corso analisi di doppia marcatura.
Per una maggiore chiarezza in merito all'espressione del gene XPDGF-B nelle cellule delle creste neurali di Xenopus laevis, ho adoperato due sonde ad RNA antisenso differentemente marcate: oltre alla sonda “classica” contenente i ribonucleotidi complessati con la digossigenina, ve ne è anche un'altra sintetizzata utilizzando ribonucleotidi complessati con la fluoresceina. Quest'analisi di doppia marcatura mi ha consentito di mettere in relazione i domini di espressione di XPDGF-B e di un marker di NCC craniche, Twist. Come da protocollo (vedi “Materiali e Metodi”), la sonda marcata con digossigenina è stata utilizzata per evidenziare il gene minormente espresso tra i due che, in questo caso, è XPDGF-B, e la rivelazione è stata fatta utilizzando come substrato cromogeno il BMPurple. L'espressione del gene Twist è stata evidenziata invece con la sonda complessata con la fluoresceina, e rivelata usando il BCIP come substrato cromogeno della fosfatasi alcalina.
Le analisi di doppia marcatura sono state condotte su embrioni fissati sia quando le cellue delle creste neurali iniziano a migrare (quindi intorno a stadio 20), in modo tale da collocare l'espressione di XPDGF-B spazio-temporalmente con la migrazione delle creste (Figura 5).
Fig. 5: domini di espressione di XPDGF-B e Twist. Esempio di embrione in visione frontale processato per
ibridazione in situ “whole-mount” doppia a stadio 18-20, utilizzando come marcatori xpdgf-b (in blu) e Twist (in azzurro).
Come possiamo vedere dalla Figura 5, nella neurula tardiva, nelle fasi più precoci della migrazione non sembra esserci alcuna sovrapposizione tra le cellule delle creste neurali, evidenziate dall'espressione di Twist, ed il dominio di espressione di XPDGF-B. Sono in corso ulteriori analisi di doppia marcatura con sonde specifiche per Twist e XPDGF-B, e per XPDGF-B e XPDGFRα, il suo recettore, per chiarire al meglio la relazione tra l'espressione di questo fattore ed un suo putativo coinvolgimento durante l'embriogenesi con la migrazione delle cellule delle creste neurali.
A questo punto, abbiamo analizzato se, anche in questo sistema in vivo lo hPDGF-B fosse in grado di alterare le capacità migratorie delle cellule delle creste neurali (NCC). Per questo motivo, è stata indotta una sovraespressione dello hPDGF-B, iniettandone il capped mRNA da un lato solo in embrioni di Xenopus allo stadio di 2-4 cellule (allo stadio di 4 cellule ho iniettato il blastomero più piccolo e più chiaro). Gli embrioni così iniettati sono stati fatti crescere fino allo stadio di nostro interesse. Abbiamo preso in esame stadi diversi proprio per poter osservare il comportamento delle cellule delle creste neurali in diversi momenti dello sviluppo embrionale.
Non è stato facile studiare il comportamento delle creste poiché uno dei primi effetti che abbiamo riscontrato a seguito della sovraespressione di hPDGF-B è stata un'alterazione dello sviluppo embrionale: infatti, moltissimi embrioni non arrivavano allo stadio di neurula o di tailbud poiché lo hPDGF-B iniettato ad alte dosi induce una esogastrulazione a stadi più precoci, oppure porta alla formazione di una spina bifida a stadi più tardivi. Negli embrioni sopravvissuti, il lato iniettato è stato discriminato dal lato di controllo mediante l'utilizzo di opportuni traccianti come la green fluorescent protein (GFP), la β- galattosidasi o i destrani. Il comportamento delle creste è stato analizzato mediante In Situ Hybridization con opportuni probes specifici per markers delle creste, come Twist, Slug, FoxD3, e con altri marker ancora.