La funzione adesiva e le potenzialità del “signalling” delle caderine classiche sono tipici di tutta l'embriogenesi. Sebbene ci siano tutta una serie di similitudini strutturali e funzionali condivise dalle caderine classiche, ci sono delle sottilissime differenze tra le varie caderine che le rendono estremamente specifiche nei vari “steps” dell'embriogenesi. Un esempio lampante è proprio il coinvolgimento delle caderine nello sviluppo delle creste neurali (Akitaya, 1992; Kimura, 1995; Inoue, 1997; Hadeball, 1998; Vallin, 1998; Borcher, 2001; Coles, 2007).
Un'immagine generale del ruolo di queste caderine durante la migrazione delle NCC può essere ricreata mettendo assieme tutto quelle che i ricercatori hanno scoperte su queste cellule nei vari sistemi modello, come G. gallus, M. musculus, X. laevis. Le creste neurali esprimono la E-caderina e la N-caderina durante l'induzione. Man mano che l'induzione procede, l'espressione della E-caderina diminuisce, mentre quella di altre caderine inizia ad aumentare. Tra queste vediamo proprio la caderina 6, la caderina 11 e la caderina 7.
Caderina 6B
La caderina 6B, una caderina di tipo II, è espressa dalle NCC craniche di pollo prima che queste inizino a migrare (Nakagawa and Takeichi, 1995), ed il suo RNA messaggero viene downregolato da Snail2 affinché queste migrino (Taneyhill et al., 2007). La caderina 6B gioca un ruolo nella EMT non appena le NCC iniziano a migrare (Coles et al., 2007; Taneyhill, 2008). Se infatti questa caderina viene inibita tramite morpholino in embrioni di pollo, viene promossa una migrazione delle NCC craniche prematura che risulta pure aumentata, mentre la sovraespressione riduce il numero di NCC in migrazione e aumenta anche la presenza di NCC ectopiche nel lumen del tubo neurale in vivo (Figura 14 e 15; Coles et al., 2007).
Fig. 14: elettroporazione di un morpholino di controllo (A-G) e di un morpholino diretto contro la caderina 6 (H-N) nella regione mesencefalica di embrioni di pollo. Ibridazioni in situ whole-mount con
sonde di RNA antisenso per Sox10 (A and H) o per Snail2 (D and K) e le sezioni indicate (rispettivamente (B e I) e (C e J)). Sezioni di embrioni processati per ibridazione in situ con sonde ad RNA antisenso per FoxD3
(E e L) e rhoB(F e M) o per immunostaining per HNK-1 (G e N). Il pannello N è molto più caudale del pannello G, mostrando una prematura migrazione delle NCC in embrioni trattati con un morpholino per la
caderina 6. In tutti i pannelli, il lato elettroporato è quello a destra, come indicato dalla colorazione fluorescente (rosso) delle cellule che hanno ricevuto il morpholino. Il trattamento con il morpholino non ha
Fig. 15: elettroporazione del morpholino diretto per la caderina 6 nella regione mesencefalica di embrioni di pollo, osservate dopo 3 ore (A e B) e dopo 20 ore (C-E) di incubazione. Nei pannelli A-C, il
lato elettroporato è quello sulla destra; i pannelli D ed E sono marcati appropriatamente. Ibridazioni in situ whole-mount fatte con sonde ad RNA antisenso per Sox10 (A e C-E) e la sezione indicata (B). Le frecce nere identificano le cellule delle creste neurali positive a Sox10 che migrano prematuramente non appena lasciano il mesencefalo (B), e in fasi più tardive mentre migrano verso la regione perioculare (C e E) che non sono
osservate nel lato d controllo (D).
La caderina 6B è è espressa all'inizio della regolazione ma poi è precocemente repressa nelle NCC vagali cardiache di pollo (Nakagawa and Takeichi, 1995), mentre l'espressione è mantenuta nelle NCC enteriche non appena loro colonizzano l'intera lunghezza del futuro tratto digerente (Breau et al., 2006).
La caderina 6B risulta coinvolta nella EMT delle NCC del tronco, coprendo un ruolo abbastanza differente da quello della N-caderina. La caderina 6B del tronco gioca un ruolo abbastanza diverso da quello che giocava nelle NCC craniche: è espressa nelle NCC del tronco prima che queste migrino e durante la EMT, ma è assente nelle NCC mentre migrano via dal tubo neurale proprio come dagli altri livelli assiali (Nakagawa and Takeichi, 1995; Park and Gumbiner, 2010). L'inibizione ed il knockdown della caderina 6B nelle NCC del tronco in pollo causa una ridotta migrazione delle NCC, mentre la sovraespressione aumenta il numero di cellule che si trovano ectopicamente localizzate nel lumen del tubo neurale (Park and Gumbiner, 2010). Questo effetto della caderina 6B nella de-epitelizzazione delle NCC del tronco è mediata da un signalling di BMP non canoninco tramite i recettori di BMP di tipo II, coinvolgendo la LIM kinase 1 che fosforila la cofilina per regolare le dinamiche dell'actina (Park and Gumbiner, 2012). Mentre l'sovraespressione della caderina 6B sia nelle NCC craniche che del tronco promuove la localizzazione ectopica delle NCC nel lumen del tubo neurale, l'inibizione o il “knockdown” hanno effetti
opposti nella EMT delle NCC craniche e del tronco. Questa può essere annoverata come una delle differenze tra le NCC craniche e quelle del tronco, come ad esempio la transizione da G1 ad S, necessaria per la EMT delle NCC del tronco ma non per quella delle NCC craniche (Burstyn-Cohen et al., 2004; Theveneau et al., 2007).
N-caderina
Sembra anche che la N-caderina di tipo I non sia espressa dalle NCC craniche del pollo in migrazione, dal momento che non è stato possibile riscontrarla tramite anticorpi marcati (Bronner-Fraser et al., 1992b; Duband et al., 1988); comunque, tramite qPCR risulta che effettivamente sia espressa (McLennan et al., 2012). Una possibile spiegazione per questa discrepanza è che un'immunoflurescenza può solo consentire la visualizzazione della N- caderina associata alle giunzioni aderenti, ma la N-caderina delle NCC in migrazione, se analizzate in vitro, è principalmente solubile e non associata con il contatto cellula-cellula (Monier-Gavelle and Duband, 1995). Al contrario, durante la migrazione delle NCC craniche negli embrioni di Xenopus l'mRNA della N-caderina e la proteina possono essere rintracciate (Theveneau et al., 2010), e sia la sovraespressione che il “knockdown” genico mediato da morpholino bloccano in vivo la migrazione delle NCC (Theveneau et al., 2010). Studi in vitro dimostrano un ruolo per la N-caderina durante la migrazione di gruppo delle NCC in Xenopus. Anticorpi bloccanti per la N-caderina impediscono l'inibizione da contatto della migrazione e la polarizzazione delle NCC craniche secondo gradiente di SDF1 (Theveneau et al., 2010). Curiosamente, le NCC craniche trattate con morpholino sono molto più mobili in coltura e si disperdono più rapidamente delle cellule di controllo (Theveneau et al., 2010).
Questo comportamento è simile a quello osservato nelle NCC migratorie cardiache in topi mutanti resi deficienti per la N-caderina, che hanno una maggiore mobilità in vitro, ma perdono di direzionalità (Xu et al., 2001). È stato proposto un modello di NCC craniche in Xenopus, nel quale le adesioni cellulari mediate dalla N-caderina portano ad una polarità dipendente dal contatto cellulare, e quando combinate con un segnale chemiotattico, consentono una chemiotassi collettiva delle NCC craniche (Theveneau et al., 2010).
Caderina 11
La caderina 11, una caderina di tipo II, è espressa durante la migrazione delle NCC craniche in topo (Kimura et al., 1995) ed in Xenopus (Hadeball et al., 1998; Vallin et al., 1998). I topi omozigoti per una mutazione che fa produrre una caderina 11 meno adesiva
hanno ossa frontali più corte, ma non risulta abbiano problemi durante la migrazione delle NCC craniche (Manabe et al., 2000), mentre l'inibizione della caderina 11 in Xenopus in vivo produce un fenotipo interessante che riguarda proprio la migrazione delle creste (Borchers et al., 2001; Kashef et al., 2009): il knockdown genico della caderina 11 inibisce la migrazione delle NCC dal secondo arco branchiale in poi, e le cellule mutanti non formano filopodi e lamellipodii (Kashef et al., 2009). Il rescue fatto per la mutazione della caderina 11 mostrava che la coda citoplasmatica della proteina era più che sufficiente per la migrazione delle NCC craniche in Xenopus, e che questa migrazione proseguiva fino a che questa restava ancorata alla membrana cellulare. Tra i domini intracellulari critici per questa caderina troviamo il sito di legame per la β-catenina ed un sito di legame per la proteina Trio, che è un fattore di scambio per la guanina; l'over-expressione di hCDH1, Trio o l'espressione di una Rho GTPasi costitutivamente attiva recuperano il fenotipo mutato per la caderina 11, mentre l'sovraespressione della caderina 6 del topo non consente il recupero della migrazione (Kashef et al., 2009).
Inoltre, il taglio di un dominio extracellulare della caderina 11 in Xenopus è necessario per la migrazione delle NCC craniche. Quindi, la caderina 11 sembra agire insiame alla β- catenina e alla proteina Trio a livello del plasmalemma per iniziare l'attività protrusiva, e tramite l'attivazione della proteina GTPasica Rho guida la migrazone delle creste. La proteina Trio, comunque, ha molti partner proteici sulla superficie cellulare (Backer et al., 2007; Briancon-Marjollet et al., 2008; Yano et al., 2011), ma non si sa se nelle NCC di Xenopus lei ne leghi altri oltre la caderina 11.
La caderina 11 è espressa nella NCC del tronco durante le prime fasi della migrazione e nel mesenchima attraverso il quale le NCC migrano (Chalpe et al., 2010). La locazione di queste cellule positive alla caderina 11 suggerisce che più ventralmente migrano le NCC del tronco che esprimono la caderina 11, e che nelle NCC che migrano più tardivamente è espressa debolmente o per nulla. Non appena le NCC aggregano nei gangli dorsali, queste esprimono più debolmente la caderina 11, mentre il mesenchima circostante è fortemente positivo per la caderina 11 (Chalpe et al., 2010). Sia la caderina 7 e la caderina 11 sono sovraespresse nelle NCC del tronco in pollo in vitro in risposta al segnale di Wnt3a, sia a livello di mRNA che di proteina in corrispondenza delle adesioni cellula-cellula (Chalpe et al., 2010), suggerendo che queste molecole di adesione sono regolate dal signalling di Wnt. La caderina 11 è espressa dalle NCC del tronco di Xenopus durante la migrazione nel pathway dorsale (Vallin et al., 1998), e la caderina 19 è espressa da una sottopopolazione di NCC del tronco in migrazione nel pathway ventrale di ratto (Takahashi and Osumi, 2005).
PCNS
Le NCC craniche di Xenopus esprimono anche una protocaderina, nota come PCNS (Rangarajan et al., 2006). Il silenziamento di PCNS tramite morfolino inibisce in vivo la migrazione delle NCC craniche, e se messe in coltura con la fibronectina queste non riescono né a migrare né a disaggregare (Rangarajan et al., 2006). Non si conosce bene l'esatta funzione di PCNS nella migrazione delle NCC craniche; comunque, è stato suggerito che PCNS può influenzare il signalling alla base della polarità cellulare, che è richiesto per l'inibzione da contatto della migrazione nelle NCC craniche (Alfandari et al., 2010).
Caderina 7 e altre caderine
La caderina 7 di pollo, la caderina 6 di topo e la caderina 19 del ratto sono delle caderine di tipo II collegate tra loro ed espresse dalle NCC durante la loro migrazione (Inoue et al., 1997; Nakagawa and Takeichi, 1995; Takahashi and Osumi, 2005); comunque, non si conosce bene un ruolo funzionale, ed i topi mutati per la caderina 6 sono vivi, senza apparenti difetti nella migrazione delle NCC craniche (Mah et al., 2000). È stato dimostrato che l'espressione della caderina 7 è diversa nella popolazione delle NCC craniche migranti: risulta infatti più espressa in quelle in coda piuttosto che in quelle che guidano la migrazione (McLennan et al., 2012), suggerendo che l'adesione cellula-cellula può essere più importante per le cellule che seguono piuttosto che per quelle che conducono. Se si usano linee cellulari trasfettate con la caderina 7, si può osservare una maggiore adesività se comparata con la caderina 11, ed ambedue queste caderine di tipo II hanno una minore adesività della N-caderina (Chu et al., 2006).