Il pattern d'espressione di XCDH6, la caderina 6 espressa in Xenopus, non è ancora stato completamente descritto in letteratura. Ho quindi voluto osservarne l'espressione tramite In Situ Hybridization in embrioni di Xenopus laevis nelle prime fasi della neurulazione e della migrazione delle cellule delle creste (stadio 15-16 e a stadio 20), e a stadi più tardivi (stadio 25 e stadio 40) (Figura 13).
Fig 13: pattern d'espressione per XCDH6. In a, embrione a stadio 15 con l'espressione di xcdh6; in b,
embrione a stadio 21; in c, embrione a stadio 25; in d, embrione a stadio 40.
Non è stato semplice fare un In Situ Hybridization per XCDH6 nella neurula, soprattutto a stadio 15-16, dato che l'espressione di questo gene inizia ad essere più apprezzabile dopo lo stadio 20 (David R. et al., 2000). Tuttavia, prolungando il più possibile i tempi della rivelazione, è stato possibile ottenere un risultato significativo.
Fig. 14: Analisi condotta mediante RT-PCR riguardante l'espressione di xcdh6 a vari stadi di sviluppo.
Il trascritto di xcdh6 compare a stadio di neurula precoce e aumenti man man che l'embriogenesi procede. Il confronto è fatto con il trascritto di un housekeeping, l'istone H4 (David R. et al., 2000).
Come possiamo vedere dalla Figura 14, la caderina 6 risulta essere davvero poco espressa a stadi precoci (stadio 15 e 16), e poi via via maggiormente espressa in stadi sempre più tardivi (stadio 20, stadio 25 e stadio 40). In laboratorio verranno condotte comunque ulteriori analisi tramite doppia marcatura, in modo tale da capire meglio quali tipologie cellulari, nei vari stadi di sviluppo, esprimano la caderina 6. Tutto quello che sappiamo finora, è che la troviamo espressa da stadio 26 in poi nel “forebrain”, nel “midbrain”, nell'occhio e nei gangli del sistema nervoso periferico appartenente a quella porzione del fascio nervoso anterodorsale che deriva dai placodi (Schlosser and Northcutt, 2000; Winklbauer and Hausen, 1983; Winklbauer, 1989; Collazo et al., 1994), e in stadi più tardivi la troviamo espressa in alcuni dei nervi cranici, e nel ganglio glossofaringeo. Dati di letteratura la vedono coinvolta nella formazione dell'occhio, come dimostrano esperimenti di perdita di funzione, ma non sembra essere importante né per la formazione dell'eye field (quindi a partire da stadio 13) né per la sua separazione (tra stadio 13 e 18) (Gui Ruan, 2006).
Abbiamo quindi voluto confermare il dato della qPCR tramite un'analisi qualitativa fatta mediante In Situ Hybridization “whole mount” (Figura 15) con le modalità sopracitate, processando embrioni di Xenopus allo stesso stadio di quelli usati per l'estrazione di RNA per la qPCR.
Inj sx
Inj dx
Fig. 15: La sovraespressione di hPDGF-B diminuisce i livelli di espressione della caderina 6. Visione
frontale di embrioni processati per ibridazione in situ a stadio 20 utilizzando come marcatore Xcdh6 (in blu). Nella colonna di sinistra, embrioni iniettati nel lato sinistro. Nella colonna di destra, embrioni iniettati nel
lato destro. Il lato iniettato ed il lato di controllo sono stati distinti mediante screening al microscopio a fluorescenza. Fenotipo 85%, n=56.
Come si può vedere dalla Figura 15, la caderina 6 sembrerebbe essere minormente espressa nel lato iniettato piuttosto che in quello di controllo in embrioni a stadio 20, mentre non sembra essere particolarmente modulata a stadio 15-16, come è possibile vedere nella Figura 16.
Fig. 16: La sovraespressione di hPDGF-B non altera significativamente i livelli di espressione della caderina 6 nella neurula precoce. Visione frontale di un embrione iniettato nel lato destro, processato per
ibridazione in situ a stadio 15-16 utilizzando come marcatore Xcdh6 (in blu). Il lato iniettato ed il lato di controllo sono stati distinti mediante screening al microscopio a fluorescenza.
Contrariamente a quanto osservato nella qPCR (Grafico 3), la caderina 6 non sembra essere significativamente modulata dalla sovraespressione di hPDGF-B. Per questo motivi abbiamo ridisegnato i primers per la qPCR con i criteri sopracitati (Tabella 2 di “Materiali e Metodi”).
La caderina 2, o N-caderina (“Neural-cadherin”), è coinvolta nella transizione epitelio- mesenchimatica venendo espressa infatti dalle cellule delle creste neurali agli esordi e durante le prime fasi della migrazione. Inoltre, si trova espressa anche a livello del tubo neurale. Come si può vedere dalla Figura 17, l'espressione della N-caderina risulta modulata dalla sovraespressione di hPDGF-B.
Figura 17: la sovraespressione di hPDGF-B altera l'espressione della N-caderina. In alto, embrioni di Xenopus laevis in visione frontale a stadio 20 processati per ibridazione in situ utilizzando come marcatore
XN-cad (in blu). In basso, embrioni di Xenopus laevis a stadio 25 processati per ibridazione in situ
utilizzando il medesimo marcatore. Il lato iniettato si distingue grazie alla colorazione rossa della reazione cromogenica con la β-galattosidasi. Fenotipo=78%, n=54.
La sovraespressione di hPDGF-B sembra indurre un'espansione del dominio di espressione della N-caderina, oltre che una fusione degli “streams” migratori delle cellule delle creste neurali. Il fenotipo presente negli embrioni concorda con quanto visto mediante ISH fatta con la sonda per il marker di creste Twist. Il fenotipo è del 78%, con n=54.
La sonda ad RNA antisenso per la caderina 11, invece, non ha funzionato bene, dando un background di segnale che non ha reso possibile una distinzione apprezzabile tra il lato di controllo e il lato iniettato.
Discussione
Il mio progetto di tesi si riaggancia ad un lavoro tutt'ora in corso, condotto dal dottor Paolo Malatesta dell'Istituto Tumori di Genova su un modello di gliomagenesi indotto dalla sovraespressione del PDGF-B, il ligando B della famiglia dei fattori di crescita delle piastrine (plateled-derived growth factor). I gliomi sono dei tumori che interessano il Sistema Nervoso Centrale, e che originano da cellule gliali, da cui il loro nome. Questi tumori, ed in particolar modo gli “high grade gliomas” (HGGs), che sono i tumori dotati del maggiore livello di malignità tumorale, sono responsabili di circa l'80% dei tumori maligni cerebrali, e sono pressoché incurabili. Ogni approccio di tipo chirurgico, oltre che particolarmente rischioso, si rivela anche abbastanza inutile, poiché questi tumori hanno una elevatissima capacità di formare molteplici foci in diverse aree cerebrali, dando vita a tumori secondari.
Era già noto da tempo che la sovraespressione del PDGF-B e del suo recettore PDGFRα fossero presenti nei gliomi, ed anche in altri tumori, di III e IV grado nel Sistema Nervoso Centrale (Hermanson et al. 1992; Nister et al. 1988). Quello che il dottor Paolo Malatesta ed il suo team hanno scoperto è che la sovraespressione del PDGF-B risulta essere responsabile dell'induzione degli HGGs e delle loro caratteristiche in termini di migrazione ed invasività, e soprattutto che risulta essere indispensabile per il mantenimento di alcune caratteristiche tumorali come l'anaplasia o la capacità di formare metastasi.
Quello su cui ci dobbiamo focalizzare non è “cosa succede”, ma “come succede”. Come può una maggiore espressione di questo fattore di crescita essere responsabile di tutte queste conseguenze? È in questo quadro che si va a collocare il mio progetto di tesi.
Ho cercato di riprodurre condizioni simili a quelle presenti nei modelli di gliomagenesi del dottor Malatesta in un particolare sistema modello: le cellule delle creste neurali di Xenopus laevis. La cresta neurale si presta bene come sistema modello per lo studio delle metastasi tumorali, dal momento che le cellule che la compongono, come sappiamo dalla biologia dello sviluppo, sono cellule multipotenti dotate di una certa plasticità genica, in grado di migrare dal tubo neurale invadendo i tessuti target. In questi poi differenzieranno in melanociti, gangli nervosi, ecc... . Ai fini della migrazione, è necessario che queste cellule vadano incontro ad un cambiamento delle forze adesive, e questo è quello che avviene durante lo sviluppo embrionale grazie ad uno “switch” di caderine noto come
“transizione epitelio-mesenchimatica”. Queste caratteristiche che ho appena elencato, le ritroviamo presenti anche nelle metastasi tumorali. La scelta poi, delle cellule delle creste neurali di Xenopus laevis come possibile modello in cui riprodurre le conseguenze di una sovraespressione del PDGF-B è anche supportata da dati di letteratura che dimostrano un'espressione del recettore PDGFRα nelle creste (C.J. Bae et al., 2013). Dal momento che non si riscontravano in letteratura pattern di espressione del PDGF-B nei vertebrati, ho voluto osservare il pattern d'espressione del gene codificante per questo fattore in Xenopus laevis e confrontarlo con quello del recettore PDGFRα. Come già detto, il gene PDGFRα è espresso nelle cellule delle creste neurali. Il gene XPDGF-B, invece, nelle fasi precoci della neurulazione (a stadio 15-16) sembrerebbe espresso nel “pre-placodal ectoderm” e nella porzione più ventrale del tubo neurale. Nella neurula tardiva (a stadio 21) mantiene la sua espressione nei placodi, ma sembra sia anche acceso nei rombomeri e nel futuro eye field. Ed infatti, anche a stadi più tardivi si può riscontrare l'espressione del gene del XPDGF-B nella porzione più ventrale della retina. Se si confrontano l'espressione del gene XPDGF-B e del gene PDGFRα allo stadio 15-16 dell'embriogenesi, si ha quasi l'impressione che XPDGF-B circondi le cellule delle creste neurali, e che più dorsalmente la sua espressione quasi si sovrapponga a quella di PDGFRα. Questo dato ci suggerisce una condizione in cui il signalling di XPDGF-B potrebbe essere coinvolto in maniera transiente, durante l'embriogenesi, all'inizio della migrazione delle cellule delle creste neurali, ed una volta che le cellule hanno iniziato ad allontanarsi dl tubo neurale, la sua espressione viene poi silenziata in quell'ambito. Infatti, dalle ibridazioni in situ “whole- mount” doppie fatte con le sonde per XPDGF-B e Twist, la mancata sovrapposizione dei due domini di espressione negli embrioni non suggerirebbe alcuna correlazione tra le fasi iniziali della migrazione delle creste e l'espressione basale del fattore di crescita delle piastrine. Tuttavia, sono in corso ulteriori analisi di doppia marcatura nelle fasi antecedenti la migrazione delle creste.
Inoltre, sono in corso anche analisi di doppia marcatura con sonde specifiche per il trascritto di XPDGF-B e per il trascritto del suo recettore PDGFRα, sia al momento della migrazione delle creste che nelle fasi antecedenti.
Il PDGF-B è in grado di alterare il “pathway” di migrazione cellulare?
Nel modello murino di gliomagenesi indotta dalla sovraespressione del PDGF-B, se cellule di HGG in cui il PDGF-B risultava sovraespresso venivano impiantate in un cervello di topo sano adulto, queste erano in grado di migrare via dal sito di iniezione, attraversando il
parenchima cerebrale. In vitro, invece, se espiantate queste cellule erano in grado di formare foci.
Inducendo la sovraespressione del PDGF-B umano (hPDGF-B) in Xenopus laevis, conformemente a quanto accade in topo, anche nelle cellule delle creste neurali possiamo osservare delle modifiche indotte al “pathway” migratorio. Questo è possibile grazie all'utilizzo di sonde ad RNA antisenso che si appaiano ai trascritti di markers di creste come Twist, Slug, FoxD3... In questo caso particolare, ho processato gli embrioni di Xenopus laevis per In Situ Hybridization “whole mount” a diversi stadi della neurulazione e a stadio di tailbud, utilizzando una sonda specifica per Twist. Negli embrioni iniettati con il capped mRNA di hPDGF-B, a stadio 20 possiamo osservare un fenotipo dose-dipendente caratterizzato da una parziale fusione degli “streams” migratori, e dall'espansione del dominio di espressione delle creste. Come dicevo, il fenotipo si può presentare più o meno marcato a seconda del quantitativo di trascritto finito all'interno dell'embrione. In caso di alte dosi di iniettato, è stato possibile anche riscontrare la presenza di cellule delle creste neurali in posizione ectopica, suggerendo così un ruolo da parte del PDGF-B di tipo chemiotattico nei confronti delle cellule delle creste neurali che colonizzano così aree ectopiche. Anche nel tailbud a stadio 25 possiamo osservare sia la fusione degli “stream” migratori e l'espansione del dominio delle creste, sia la comparsa di creste ectopiche. Questo dimostra che, con il procedere dell'embriogenesi non si ha alcun recupero delle alterazioni indotte dalla sovraespressione di hPDGF-B, ed infatti il fenotipo viene mantenuto. Sono stati processati per ibridazione in situ anche embrioni agli stadi più precoci della neurulazione (a stadio 13-14), in modo tale da capire a partire da quale stadio il PDGF-B inducesse questa alterazione nel comportamento delle creste. In una fase così precoce della neurulazione, le cellule delle creste neurali non iniziano ancora a migrare, ed infatti non si può assistere ad alcuna fusione degli “stream” migratori. Tuttavia, si può riscontrare una lieve espansione del dominio delle creste che non sembra essere dose- dipendente viste che sia ad alte che a basse dosi di iniettato il fenotipo non sembra variare molto, e che non risulta così evidente come a stadi più tardivi come dimostrato dalla percentuale dei fenotipi. Questo fenomeno probabilmente è collegato proprio alla precocità dello stadio, in cui le cellule delle creste neurali iniziano ad essere differenziate dal restante neuroepitelio, ma ancora non hanno iniziato la migrazione e ancora non hanno espresso quel set di molecole di adesione necessario proprio alla migrazione. Non si può dire lo stesso per quanto riguarda stadi più tardivi della neurulazione come a stadio 15-16, in cui è possibile riscontrare la presenza di creste neurali in posizione ectopica. Questo dato è
particolarmente interessante dal momento che, come sappiamo, le cellule delle creste neurali non migrano a questi stadi precoci della neurulazione, suggerendo quindi un ruolo del PDGF-B o come possibile chemioattrattante, o anche come possibile induttore di cellule delle creste neurali. Questa seconda ipotesi sembrerebbe però essere meno probabile a causa della mancata presenza di creste ectopiche negli stadi di fine gastrula /inizio neurula fase in cui a cui l’ectoderma risponde ai segnali induttivi che originano le creste neurali.
A proposito di molecole coinvolte nelle forze adesive cellula-cellula, tramite analisi di comparazione del profilo genico fatta con “microarray” dal dott. Malatesta, che vedeva un confronto del trascrittoma tra cellule che presentavano una persistente sovraespressione del PDGF-B ed un fenotipo migratorio raffrontabile con quelle delle cellule metastatiche, e cellule che erano andate incontro ad un silenziamento spontaneo del PDGF-B dopo la sua espressione indotta, e che avevano perduto le caratteristiche migratorie e di invasività mostrate dalle cellule precedenti, sono state trovati tutta una serie di geni maggiormente espressi, la cui sovraespressione potrebbe essere ricondotta proprio alla sovraespressione del PDGF-B. Tra questi geni, la caderina 4 (meglio nota come R-caderina). Questa caderina è sempre stata oggetto di controversie, sin dalla sua scoperta a livello della retina di pollo (da qui la “R”) (Inuzuka et al., 1991). La R-caderina sembra sia in grado sia di promuovere la progressione tumorale (Kucharczak et al., 2008), sia di inibirla (Miotto et al., 2004; Agiostratidou et al., 2009; Zou et al., 2009; Du et al., 2011). In entrambi i casi, è fuor di dubbio che la R-caderina sia importante, anche se il suo comportamento sembra essere contesto-dipendente. Il dottor Malatesta ha suggerito che le cellule di glioma in cui è presente una sovraespressione del PDGF-B vadano incontro ad un secondo “switch” di caderine che prevede una de-localizzazione della N-caderina dalle giunzioni aderenti (anche se i livelli di trascritto della N-caderina non diminuiscono), e la sostituzione con la R-caderina. Quest'ipotesi è supportata dal fatto che, se alle cellule che hanno silenziato la sovraespressione indotta del PDGF-B è indotta la sovraespressione della R-caderina, si assiste alla perdita dell'inibizione da contatto in vitro, ma non ad un incremento della migrazione in vivo. Questo dato ci suggerisce che la R-caderina venga espressa maggiormente a seguito di sovraespressione del PDGF-B, e che possa essere responsabile di alcune delle caratteristiche presenti nelle cellule di glioma metastatiche, ma che la sua sovraespressione non ricapitoli interamente la sovraespressione del PDGF-B.
Per questo motivo, ho voluto analizzare i livelli di espressione della R-caderina in Xenopus a seguito di una sovraespressione del PDGF-B umano sia in maniera quantitativa tramite
qPCR, che in maniera qualitativa tramite ibridazione in situ. Ho quindi estratto l'RNA da embrioni di Xenopus in cui era la sovraespressione del PDGF-B era stata indotta in tutto l'embrione e da embrioni “wild type”, così da poter comparare come variassero i livelli di espressione della R-caderina a seguito della sovraespressione del PDGF-B. Da questi, ho estratto l'RNA, l'ho retrotrascritto e ho comparato l'espressione della R-caderina tra embrioni iniettati e non, confrontandola con quella di un housekeeping i cui livelli di espressione non fossero influenzati dal trattamento.
Nella neurula tardiva (a stadio 20), la R-caderina non aumenta a seguito di sovraespressione di hPDGF-B. Questo tornerebbe con quello che sappiamo sulla sovraespressione della R-caderina in Xenopus laevis, dal momento che questa caderina è inizialmente espressa come trascritto materno dopo la fecondazione, ed inizia ad essere espressa come trascritto zigotico negli stadi più tardivi in cui avviene il differenziamento dei componenti del Sistema Nervoso, come ad esempio gli occhi (come avevamo detto, la R-caderina è coinvolta nello sviluppo della retina). Infatti, tramite ibridazione in situ fatta a stadi più tardivi (a stadio 35-37), la R-caderina risulta qualitativamente più espressa a seguito di sovraespressione di hPDGF-B. Tuttavia, se riproponiamo l'ibridazione in situ nella neurula tardiva (a stadio 20), non la troviamo minimamente espressa, confermando così quanto osservato tramite qPCR. Questo dato ci indica che la sovraespressione di hPDGF-B non induce l'espressione della R-caderina nelle cellule delle creste neurali, escludendo ogni suo coinvolgimento nel fenotipo regolatorio.
Forzando il sistema modello tramite induzione della sovraespressione della R-caderina nelle cellule delle creste neurali, questa porta ad un fenotipo del tutto paragonabile a quello osservato con la sovraespressione di hPDGF-B, anche per quanto riguarda le frequenze con cui questo fenotipo compare nelle ibridazione in situ fatte con i vari markers di creste. E, conformemente a quanto osservato dal dottor Malatesta, anche in questo sistema modello, la sovraespressione della R-caderina non ricapitola completamente quanto osservato con la sovraespressione del PDGF-B. Non si osservano infatti né l'espansione del dominio delle creste, né tanto meno la comparsa di creste ectopiche. Questo ci dice che, sebbene il PDGF-B non sia in grado di indurre la R-caderina nelle cellule delle creste neurali, la R- caderina da sola è in grado di alterare il comportamento delle cellule delle creste nella neurula tardiva.
Inoltre, la sovraespressione della R-caderina sembrerebbe essere responsabile della perdita dell'inibizione da contatto, dal momento che comporta una fusione degli “stream” migratori, ma non di una maggiore migrazione. Anche questo dato conferma quanto
osservato dagli esperimenti dottor Malatesta, in cui cellule di glioma in cui veniva indotta la sovraespressione della R-caderina, divenivano in grado di ignorare i meccanismi dell'inibizione da contatto esattamente come una cellula di HGG, ma non ne acquisivano le capacità migratorie.
A questo punto del mio progetto di tesi, mi sono chiesta quali potessero essere, quindi, le molecole di adesione responsabili del fenotipo osservato nelle creste neurali a seguito della sovraespressione dello hPDGF-B, ed in particolare se fosse possibile individuare molecole di adesione regolate dal PDGF-B in grado di alterare il comportamento delle creste. Per questo motivo, sono state selezionate quattro caderine coinvolte nella migrazione delle cellule della cresta neurale, che sono la N-caderina, la caderina 6, la caderina 11 e la protocaderina PCNS. L'idea di base è quella di analizzare anche queste caderine sia qualitativamente con un ibridazione in situ, sia quantitativamente con una qPCR.
Nonostante tutti i triplicati biologici e sperimentali fatti per la qPCR, la variabilità intrinseca degli embrioni e quella associata alla quantità di mRNA di hPDGF iniettato di volta in volta, si riflettono in una variabilità anche a livello fenotipico, che si riscontra sia qualitativamente con l'ibridazione in situ, sia quantitativamente con la mancanza di un trend significativo nella qPCR. Sono perciò attualmente in corso ulteriori analisi sull'espressione genica delle caderine, condotte sia nelle fasi precoci della migrazione delle cellule delle creste neurali (stadio 20-21), sia nelle fasi precoci della neurulazione prima che le cellule delle creste migrino (a stadio 15-16).
Sono state condotte anche analisi qualitative dell'espressione di queste caderine, come già precedentemente accennato. L'ibridazione in situ fatta con un marcatore per la N-caderina ha mostrato, nel lato in cui era presente la sovraespressione del PDGF-B, un fenotipo del tutto simile a quello visto a seguito di ibridazione in situ fatta per visualizzare l'espressione di Twist. È possibile visualizzare, infatti, un espansione del dominio di espressione della N-caderina ed una fusione degli “streams” migratori sia nella neurula tardiva che nel tailbud. Questo avviene perchè la N-caderina, come sappiamo, è anche espressa nelle cellule delle creste neurali a partire dalla transizione epitelio-mesenchimatica, e poi durante