Analisi funzionale delle connessine wt e mutate

Le mutazioni da noi riscontrate nei pazienti analizzati, sono posizionate in domini della proteina molto importanti per la localizzazione in membrana (G11E) e per l’assemblaggio (D50N) delle giunzioni gap. Al fine di studiare eventuali diversità nella funzionalità delle connessine mutate rispetto alla connessina normale (wild type-WT), abbiamo deciso di clonare la sequenza codificante della connessina WT e delle forme mutate all’interno di un vettore d’espressione per le cellule di mammifero (pcDNA 3.1). I costrutti sono stati sequenziati e quindi trasfettati transientemente in una linea cellulare di osteosarcoma umano (SAOS-2), che non esprime la connessina 26 endogena. Dopo 24h dalla trasfezione abbiamo eseguito una immunofluorescenza al fine di valutare eventuali differenze nell’espressione dei costrutti esprimenti le connessine mutate con quello WT. Come si può osservare dal pannello in figura 4, la colorazione, specifica per la Cx26, nelle cellule esprimenti il costrutto WT, mostrava la presenza in membrana della proteina associata a quella presente nel citoplasma, specificatamente nelle vescicole di trasporto caratteristiche della biosintesi delle connessine (Mese et al., 2007). Al contrario, le cellule trasfettate con entrambi i costrutti esprimenti le connessine mutate mostrano una colorazione citoplasmatica, suggerendo l’ipotesi di un difetto nella localizzazione in membrana delle connessine che portano le mutazioni G11E e D50N (Figura 4).

Durante questi esperimenti di trasfezione e di immunofluorescenza, abbiamo notato anche un minore espressione del mutante G11E associato ad un aumento di letalità cellulare (Figura 5). Il pannello mostra come l’espressione della Cx26 WT, colorata in verde, sembra essere maggiore rispetto ai due mutanti. Per chiarire i meccanismi responsabili di questo evento abbiamo deciso di valutare se le cellule esprimenti i due mutanti potessero andare incontro a morte cellulare mediante analisi citofluorimetrica. Abbiamo trasfettato le cellule SAOS-2 e a 24 ore dalla trasfezione le abbiamo raccolte e analizzate utilizzando la metodica dell’annessina V (AV)- Ioduro di Propidio (PI) che permette di determinare la percentuale di cellule apoptotiche in una data popolazione grazie alla misurazione del legame della AV con la fosfatidilserina, che durante il processo apoptotico si sposta dal foglietto interno a quello esterno della membrana plasmatica. L’utilizzo della doppia marcatura AV-PI permette di distinguere nei campioni in analisi le cellule vive (AV negative, PI negative), le cellule apoptotiche (AV positive, PI negative) e le cellule necrotiche (AV positive, PI positive). Dal grafico mostrato in figura 6a è possibile notare che

non ci sono differenze significative tra le cellule esprimenti i differenti costrutti. Questo dato ci permette di affermare che la morte cellulare non è associata a fenomeni apoptotici. Lo stesso esperimento ci ha permesso di dimostrare che l’espressione della connessina mutata G11E è in grado di indurre morte cellulare via necrosi (Figura 6b). Al fine di quantificare l’effetto della connessina mutante G11E in questo fenomeno, abbiamo ripetuto l’esperimento di trasfezione e dopo 24 ore abbiamo analizzato i nostri campioni al citofluorimetro mediante un saggio specifico per valutare i livelli di necrosi nelle varie popolazioni cellulari. Questo metodo si basa sull’utilizzo della fluoresceina di-acetato (FDA) associata al propidio ioduro: questa colorazione ci permette di stabilire la vitalità cellulare. L’idrolisi della fluoresceina diacetato misura l’attività complessiva di enzimi, come le esterasi, coinvolti nel metabolismo della cellula: quindi solo le esterasi di membrana delle cellule vive sono in grado di processare il colorante che viene accumulato nelle cellule vitali. Ciò ci permette di avere un dato più specifico sulla vitalità cellulare. Dal grafico presente in figura 7a, possiamo notare un incremento significativo dei livelli di necrosi nelle cellule esprimenti la connessina che porta la mutazione G11E rispetto al WT e al mutante D50N che raggiungono il 30%. Anche nelle cellule esprimenti il mutante D50N vi è un aumento dei livelli di necrosi, circa il 12%, ma non sembra essere rilevante. A questo punto possiamo concludere che l’espressione della connessina mutata G11E induce morte cellulare via necrosi. Abbiamo deciso di approfondire lo studio dei livelli di necrosi per quel che riguarda il mutante G11E effettuando esperimenti di cotrasfezione tra la Cx26 WT e quella mutata. I due vettori contenenti i cDNA WT e mutato della connessina 26 sono stati cotrasfettati a differenti ratio al fine di valutare l’effetto che il mutante G11E può avere sul WT. Il grafico mostrato nella figura 7b evidenzia l’effetto dominante della mutazione rispetto al WT in quanto già ad una ratio del 40% la connessina mutante riesce indurre morte cellulare per necrosi.

Figura 4. Immunolocalizzazione delle connessine wt e mutate. Il pannello mostra la localizzazione delle connessine wt e mutanti. In alto è rappresentata l’espressione della connessina 26 wild type (in rosso) e come si può osservare la localizzazione è prettamente in membrana e solo in parte nel citoplasma, nello specifico nelle vescicole di trasporto. Al contrario la colorazione delle due connessine mutanti ci mostra una localizzazione esclusivamente citoplasmatica (barra= 20µm).

Figura 5. Differenze di trasfezione tra i costrutti wt e mutati. Il pannello mostra una significativa differenza di espressione della connessina 26 wt ( colorata in verde) rispetto alle connessine mutate (barra=10µm).

Figura 6. Analisi dei livelli di apoptosi. (a) Il grafico mostra che non ci sono differenze significative tra i livelli di apoptosi nelle differenti popolazioni cellulari analizzate. (b) La tabella indica i livelli di mortalità cellulare rilevati durante l’esperimento con la metodica dell’annesina V. Dopo 12h i livelli di trasfezione risultano essere paragonabili tra le tre popolazioni in esame. Al contrario dopo 24h dalla trasfezione i livelli della connessina 26 mutata G11E risultano essere drasticamente ridotti (3%). Questo fenomeno è associato ad un aumento (fino al 53%) dei livelli di mortalità delle cellule esprimenti la connessina 26 mutata G11E.

Figura 7. Vitalità cellulare. (a) Il grafico mostra l’aumento dei livelli di necrosi all’interno delle cellule che esprimono la connessina mutata G11E (30%) rispetto alle cellule che esprimono la Cx26 wt (3%) e la Cx26 mutata D50N (12%). (b) Il grafico mostra la capacità della connessina mutata G11E di indurre necrosi nelle cellule in cui è espressa anche in esperimenti di cotrasfezione con la connessina 26 wt, mostrando quindi un effetto dominante.