Organizzazione strutturale delle connessine e delle giunzioni comunicanti.

Le giunzioni comunicanti sono strutture di membrana altamente specializzate, costituite da una serie di canali. Affinché avvenga la formazione delle giunzione gap due cellule adiacenti devono essere ad una distanza non superiore ai 2-4 nm (Bruzzone et al., 1996; White and Paul, 1999). I membri della famiglia delle connessine mostrano una elevata similarità strutturale. Ogni connessina è costituita da quattro domini transmembrana che rappresentano il poro del canale. Questi domini sono connessi da due loop extracellulari che svolgono un ruolo nel riconoscimento cellula-cellula e nel processo di contatto. I domini transmembrana ed i loop extracellulari sono altamente conservati tra i membri della famiglia. Queste proteine hanno anche la porzione intracellulare costituita da un N- e C-terminale e da un loop citoplasmatico che lega il secondo ed il terzo dominio transmembrana (Figura 20a). Sebbene il dominio N-terminale sia molto conservato, il loop citoplasmatico ed il dominio C-terminale mostrano una grande variabilità a livello di sequenza amminoacidica e di lunghezza che determina la specificità di ogni singola connessina. Il loop citoplasmatico ed il dominio C-terminale subiscono modificazioni post-traduzionali (fosforilazione) che hanno un ruolo regolatorio (Cruciani and Mikalsen, 2002). Molte delle connessine sono fosfoproteine e la fosforilazione è considerata importante per la regolazione dell’assemblaggio e per la modulazione alla base della fisiologia dei canali (Lampe and Lau, 2004; King and Lampe 2005). La biosintesi delle proteine che costituiscono le giunzioni comunicanti ed il loro assemblaggio sono altamente regolati. Le connessine sono caratterizzate da una emivita breve, di solo poche ore (Musil et al., 2000). La combinazione di sei molecole di connessina porta alla formazione di un emicanale denominato connessone; questo processo avviene in maniera progressiva, parte dal reticolo endoplasmatico e si conclude nel Golgi (Musil and Goodenough, 1993; Sarma et al., 2002; Laird 2006). I connessoni sono trasferiti poi sulla superficie della cellula attraverso delle vescicole che vanno a fondersi con la membrana plasmatica. Questi emicanali possono diffondere liberamente

attraverso le regioni di contatto della cellula al fine di trovare un connessone “compagno” nelle cellule adiacenti cosi da completare la formazione di canali intercellulari (Figura 20b.) (Harris, 2001). Questi canali si organizzano elle vere e proprie placche delle giunzioni comunicanti. Questo è un evento altamente dinamico che coinvolge la rimozione dei vecchi canali dal centro della placca, consentendo ad una nuova sub-unitá della giunzione gap di essere aggiunta (Gaietta et al., 2002). I canali intercellulari che vengono rimossi dal centro della placca sono inglobati all’interno di strutture vescicolari chiamate “giunzioni anulari” (Jordan et al., 2001che possono fondersi con i lisosomi, oppure essere indirizzate verso la via del proteosoma per la degradazione proteica dei loro componenti (Laing and Beyer, 1995; Musil et al., 2000; Qin et al., 2003). La continua sintesi e degradazione delle connessine attraverso questi meccanismi può spiegare il rapido adattamento dei tessuti ai diversi cambiamenti delle condizioni ambientali. Singoli connessoni possono risultare funzionali in determinate condizioni di stress, come ad esempio lo stress di origine meccanica. In tal caso questi emicanali aperti possono facilitare il rilascio di una grande varietà di fattori quali l’ATP, il glutammato, e il NAD+ _{nello spazio extracellulare, generando}

differenti risposte fisiologiche (Evans et al., 2006). Non è ancora chiaro se questi emicanali attivi vengono degradati solo dopo la formazione delle giunzioni gap o se seguono una via degradativa differente.

Nel genoma umano sono stati identificati almeno 21 geni che codificano per differenti isoforme delle connessine, e quasi tutte le cellule del corpo esprimono almeno uno di questi geni sia durante lo sviluppo embrionale che nella vita post-natale ed adulta. Ad esempio la Cx26 è altamente espressa nella coclea, nel fegato, nella pelle e nella placenta, mentre le Cx46 e Cx50 sono state trovate esclusivamente nell’occhio. In ogni caso, le connessine mostrano un modello di espressione sovrapponibile in quanto una singola cellula può esprimere più di una isoforma. Infatti nei cheratinociti sono espresse le Cx26, Cx30, Cx30.3, Cx31, Cx43, ed altre (Wiszniewski et al., 2000; Kretz et al., 2003), mentre nei cardiomiociti troviamo le Cx31.9, Cx40, Cx43, Cx45 (Beyer et al., 1995; Bukauskas et al., 2006). La coespressione di geni diversi all’interno di una singola cellula può portare alla formazione di connessoni e di canali completi misti. I connessoni possono essere costituiti sia da un singolo tipo di connessina che da più di uno con la conseguente formazione rispettivamente di emicanali omomerici ed eteromerici. Inoltre è stato descritto che l’assemblaggio dei canali completi può avvenire attraverso combinazioni differenti: i canali omotipici sono formati dal contatto di due connessoni omomerici o da due connessoni

eteromerici di uguale composizione, mentre i canali eterotipici sono composti da due emicanali (omomerici o eteromerici) di diversa composizione (Figura 20b.). L’assemblaggio di queste strutture dipende dalla compatibilità delle connessine che formano gli emicanali. Non tutte le connessine, infatti, sono in grado di interagire tra loro. Ad esempio, la Cx26 puo formare canali eteromerici con la Cx30 o con la Cx32, ma, non forma canali funzionali con la Cx40 (Segretain and Falk, 2004). Queste complesse interazioni comportano un aumento della diversità e complessità strutturale e funzionale dei canali, aumentando cosi la possibilità di scambio tra le cellule e la varietà di metaboliti trasmessi.

Figura 20. Rappresentazione schematica delle connessine e dei canali

comunicanti. (a) Le connessine sono costituite da quattro domini transmembrana, due domini extracellulari, un loop-citoplasmatico e da due domini N- e C-terminali intracellulari. (b) Assemblaggio delle connessine e formazione delle giunzioni comunicanti.

Figura 21. Permeabilità selettiva delle giunzioni comunicanti ai secondi messaggeri. (a) Le giunzioni comunicanti sono uniche in termini di selettività. (b) Differenza di permeabilità ai secondi messaggeri tra le giunzioni comunicanti formate da diverse connessine.