Analisi molecolare del gene TGM1 in pazienti affetti da ittiosi lamellare

L’ittiosi lamellare è un disturbo congenito della cheratinizzazione che si trasmette in maniera autosomica recessiva. In questo lavoro abbiamo analizzato 60 pazienti, clinicamente eterogenei, tutti con diagnosi di cheratidermia ittiosiforme non bollosa. Alcuni dei pazienti presentano un fenotipo ittiosico più accentuato rispetto ad altri, hanno cioè le caratteristiche placche marroni diffuse su una superficie molto estesa del corpo e alcune caratteristiche addizionali quali la cheratodermia palmoplantare.

Per ogni paziente è stato costruito l’albero genealogico della famiglia di provenienza al fine di evidenziare se il tipo di trasmissione del difetto epidermico era autosomica recessiva e probabilmente riconducibile alla malattia da noi studiata.

Successivamente è stata prelevata una biopsia di pelle di 3 mm ad ogni paziente, dalla quale, è stato raccolto il materiale biologico necessario per effettuare un esame istologico in microscopia ottica ed elettronica.

In seguito abbiamo sottoposto i pazienti ad analisi genetico-molecolari per indagare la presenza di mutazioni nel gene TGM1 codificante per l’enzima TGasi1. Dalle biopsie dei pazienti abbiamo estratto l’RNA e da questo, mediante retrotrascrizione (vedi materiali e metodi) siamo riusciti ad amplificare l’intera regione codificante del gene (cDNA) in maniera specifica. I cDNA così ottenuti sono stati in seguito amplificati mediante PCR e successivamente sequenziati con primer senso e antisenso basati sulla sequenza pubblicata, al fine di analizzare l’intera regione codificante.

Dall’analisi delle sequenze abbiamo riscontrato, in 14 dei 60 pazienti analizzati, delle mutazioni all’interno del gene TGM1. Tra queste vi sono 4 mutazioni non ancora descritte e 10 ben descritte in letteratura che rappresentano un ampio spettro delle caratteristiche mutazioni dell’ittiosi lamellare associate alla TGasi1 (Tabella 1).

Dei 60 pazienti analizzati, diagnosticati per l’ittiosi lamellare, la maggior parte mostravano un fenotipo severo, caratterizzato dalla presenza dei chiari sintomi di questa patologia, come le grandi scaglie marroni che ricoprono l’intero corpo e la caratteristica membrana colloidale (collodion baby) presente alla nascita. Abbiamo analizzato anche dei pazienti con un fenotipo meno severo ma in ogni modo ben distinguibile.

Nel paziente numero 1 abbiamo riscontrato una mutazione gia descritta in letteratura, si tratta di una sostizuione nucleotidica nell’esone 11 del gene TGM1 che comporta il cambiamento dell’aminoacido Glu in posizione 520 con l’aminoacido Gly (Esposito et al., 2000) (Tabella 1). Il paziente in esame presentava il classico fenotipo dell’ittiosi lamellare con la presenza alla nascita della membrana colloidale poi sostituita dalle grandi scalgie spesse di colore marrone che ricoprivano l’intero corpo.

Anche nel paziente numero 2 sono state riscontrate le caratteristiche cliniche della patologia corrispondenti ad un fenotipo molto severo, simile a quello descritto nel paziente 1. L’analisi molecolare del probando ha evidenziato una mutazione nel sito accettore di splicing (AG>GG) posizionato al 3’ dell’introne 5. Questa sostituzione nucleotidica comporta un difetto nel meccanismo di splicing con la conseguente inserzione dell’intero introne 5 nella sequenza codificante della TGasi1 che risulta nella generazione di un codone di STOP prematuro. L’inserimento di un codone do STOP prematuro causato dal mancato splicing dell’introne 5 causa la formazione di una proteina tronca che perde il dominio catalitico situato all’interno dell’esone 7. L’attività enzimatica di questa proteina può quindi essere drasticamente ridotta. Questa mutazione è stata in precedenza ben caratterizzata (Huber et al., 1995) ed è una mutazione ricorrente nei pazienti affetti da ittiosi lamellare (LI). Abbiamo, infatti, riscontrato questa stessa mutazione in altri cinque pazienti da noi presi in esame (5, 6, 8, 11, 13) che presentavano caratteristiche cliniche similari al paziente numero 2.

Nel paziente numero 3 abbiamo riscontrato una mutazione già descritta in letteratura, caratterizzata dalla sostituzione dell’aminoacido arginina in posizione 142 con l’aminoacido istidina (Huber et al., 1995). Questa mutazione è situata nell’esone 3, all’interno del dominio b-sandwich della trnsglutaminasi 1. Durante la nostra analisi dei pazienti, affetti da ittiosi lamellare, abbiamo riscontrato altre tre mutazioni, in altrettanti soggetti, caratterizzate da sostituzioni aminoacidiche, già presenti in letteratura. Due di queste erano situate nell’esone 5 (Ser272Pro; Arg282Gln), la terza invece è stata trovata nell’esone 7 (Val582Met) dove è situato il dominio catalitico dell’enzima (Esposito et al., 2001; Cserhalmi-Friedman et al., 2001; Petit et al., 1997).

L’analisi della sequenza del cDNA della TGM1 dei pazienti 9 e 12 ha evidenziato la presenza di una nuova mutazione, che nello specifico comporta la sostituzione dell’aminoacido arginina in posizione 315 con l’aminoacido istidina. Entrambi i pazienti mostravano le stesse caratteristiche cliniche e lo stesso grado di severità del fenotipo con grandi

scaglie di colore marrone che ricoprivano l’intera superficie del corpo. Questi pazienti non avevano legami di parentela tra loro.

Nel paziente 10 abbiamo riscontrato due distinte mutazioni in eterozigosi in due diversi domini della proteina. La prima, situata nell’esone 2, nel dominio β-sandwich, è una sostituzione aminoacidica. La sostituzione nucleotidica di una adenina con una guanina comporta il cambiamento dell’aminoacido arginino in posizione 42 con l’aminoacido glicine. La seconda mutazione riscontrata in questo paziente è una delezione di cinque nucleotidi (GAAGTdel) a cavallo del sito donatore di splicing dell’esone 10 che comporta il cambiamento del registro di lettura con la conseguente formazione di un codone di STOP prematuro. Entrambe queste mutazioni non sono state ancora riportate in letteratura.

Nel paziente numero 14 abbiamo riscontrato una mutazione non ancora descritta in letteratura. La sequenza del DNA del probando ha evidenziato una sostituzione nucleotidica che comporta il cambiamento dell’acido glutammico in posizione 519 con un codone di STOP prematuro. Questa mutazione è stata confermata anche mediante digestione enzimatica; infatti il cambiamento nucleotidico, nello specifico la sostituzione di una guanina con una timina, comporta la perdita di un sito di restrizione per l’enzima BseRI (Figura1b) (vedi descrizione nel paragrafo successivo).

Le mutazioni riscontrate durante il nostro studio rappresentano uno spettro abbastanza ampio delle tipologie delle mutazioni caratteristiche della TGasi1 responsabili di un fenotipo di ittiosi lamellare. Alcune rappresentano delle mutazioni che portano alla sostituzione di un aminoacido, altre invece sono caratterizzate da sostituzioni di singole basi, nei siti di splicing molto conservati (Tabella 1).

Tabella 1. Elenco mutazioni. La tabella riassume le mutazioni riscontrate durante il nostro lavoro.