In tutti gli esperimenti sulla vitalità cellulare, l’assorbanza è stata misurata ad una lunghezza d’onda di 450 nm con un lettore multipiastra (EnSpire®; PerkinElmer, Wellesley, MA, USA); in particolare, la vitalità è stata calcolata come percentuale di assorbanza esibita dalle cellule sottoposte a trattamento rispetto alle cellule trattate con il corrispondente veicolo e a ciascun dato è stato sottratto il corrispettivo bianco, ossia il valore di assorbanza relativo alla soluzione presente nei pozzetti privi di cellule.
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Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e ripetuti almeno tre volte per un n ≥ 9 e i valori ottenuti sono stati espressi come media ± errore standard.
Per la comparazione dei risultati, infine, è stato utilizzato il test statistico ANOVA a due vie seguìto da post-test di Dunnett o da test t di Student; un livello di P<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
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Capitolo 4
Risultati e discussione
Il lavoro sperimentale di questa tesi di Laurea si colloca dunque in un processo interdisciplinare di drug discovery che mira a scoprire nuove molecole e a comprendere le principali relazioni struttura-attività (SAR), definendo alcuni prototipi di farmacoforo, dove possibile.
In accordo con i dati presenti in letteratura, nel modello sperimentale utilizzato si è ricorsi all’uso del resveratrolo, che in linea con i suoi molteplici meccanismi d’azione ha portato ad un significativo aumento dell’attività di SIRT1-mediata, in maniera concentrazione-dipendente (pEC50= 97.5 µM; EC50= 29.4±0.15 µM ) (Grafico 1).
0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 R e s v e r a t r o lo m ic r o M F lu o r e s c e n z a e m e s s a %
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Al contrario la suramina ha portato ad una riduzione dell’attività mediata dalla sirtuina 1, a conferma del fatto che in condizioni basali SIRT1 svolge un’attività potenzialmente significativa.
Primo obiettivo di questa tesi di laurea: i risultati ottenuti dal saggio enzimatico preliminare condotto sull’attivatore di SIRT1 di riferimento, resveratrolo, ci forniscono le coordinate dei dati di lavoro e, al tempo stesso, confermano la corretta esecuzione del metodo sperimentale, messo a punto in questo laboratorio di ricerca per la prima volta.
Sulla base di analogie strutturali, di considerazioni sulle relazioni struttura-attività e sulla presenza di eventuali elementi di bioisosteria, è stata presa in considerazione una prima serie di derivati, strutturalmente correlabili al resveratrolo, da sottoporre a valutazione farmacologica.
In particolare sono stati testati composti contenenti un sistema bifenilico, con esposte, su uno dei due anelli benzenici (anello A), una funzione idrossi-immino-metilenica e un ossidrile fenolico in posizioni variabili.
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SERIE 1
Figura 36. Struttura chimica dei composti della SERIE 1.
Nel sistema bifenilico si osserva una riduzione degli spazi del link di collegamento dei due anelli aromatici tipico della molecola di resveratrolo e, oltre i sostituenti sull’anello A sopra citati, si può avere funzionalizzazione anche dell’anello B, dove in posizione 3 e 4 sono generalmente presenti differenti sostituzioni, sopratutto in R1 si trova sempre un gruppo ossidrilico o metossilico, mentre più eterogenea è la sostituzione in 3, in cui osserviamo l’eventuale presenza di alogeni o metili.
Grafico 2. Lettura spettrofluorimetrica dell’attività sull’enzima SIRT1 dei composti della SERIE 1, confrontati con resveratrolo (100%) e suramina.
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Mantenendo la sostituzione sull’anello A invariata e modificando i sostituenti sull’anello B, si sono osservate le variazioni sull’attività di SIRT1.
MMC-49 è il composto più semplice di questa serie, non porta sostituenti sull’anello B ed esplica un effetto di modesta tendenza alla stimolazione di SIRT1, che si assesta attorno al 20%, prendendo come 100% l’effetto sviluppato dal resveratrolo alla concentrazione di 100 microM.
In ADC254, l’introduzione di un ossidrile in posizione 4 dell’anello B, porta ad un significativo aumento rispetto al composto MMC-49, sebbene l’attività sviluppata rimanga sempre molto modesta, se confrontata a quella del resveratrolo. D’altra parte non sorprende molto questa tendenza ad incrementare, seppur lievemente, l’attività stimolatoria, poiché anche nel resveratrolo sono presenti gruppi ossidrilici in entrambi gli anelli aromatici.
Introducendo, anziché un gruppo ossidrilico come nel composto ADC254, un atomo di fluoro (MMC-48) si ha una riduzione dell’efficacia, con comportamento analogo a quello mostrato da MMC-49 e ciò porta ad ipotizzare che il guadagno ottenuto precedentemente sia più legato alla capacità dell’ossidrile di donare ponti a idrogeno, piuttosto che accettarli, sebbene anche fattori correlati a influenze elettroniche dell’alogeno non possano essere esclusi.
Nel composto TM20 la sostituzione dell’ossidrile in posizione 4 dell’anello benzenico B con un gruppo metossilico, conduce ad una totale abolizione degli effetti esercitati su SIRT1, inattività che ancora suggerisce l’importanza delle proprietà relative allo scambio dei ponti a idrogeno, nel favorire l‘attività enzimatica di SIRT1. Tale considerazione sembra convalidata dall’attività quasi nulla del composto TM19, nel quale a fianco del metossile sull’anello B, troviamo un gruppo metilico.
Analoga perdita di efficacia in termini di stimolazione sirtuinica, si osserva con lo spostamento del gruppo ossidrilico dalla posizione 3 alla 4 dell’anello B, nel composto LC77, il quale perde ogni attività stimolante SIRT1.
Da questi risultati possiamo dedurre che la presenza del gruppo ossidrilico in posizione 4 dell’anello B è un requisito molto positivo ai fini di una modulazione positiva dell’attività sirtuinica. Partendo da questo presupposto e mantenendo dunque questa sostituzione, è stato portato avanti uno sviluppo ulteriore di queste molecole,
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inserendo, in modo addizionale, sostituenti in posizione 3 dell’anello B. L’introduzione di un atomo di fluoro in questa posizione (composto TM16), porta ad un modestissimo e non significativo guadagno nell’attivazione di SIRT1; analoghi risultati sono stati ottenuti con la presenza di un cloro (composto IP38) o di un gruppo metilico (composto ADC265). È da notare che gli incrementi osservati sono modesti e che quindi i composti della serie 1 presentano un’efficacia molto inferiore rispetto a quella del resveratrolo (Tabella 3).
Nome composto Attività massima %
RESVERATROLO 100μM 100±0.0% MMC-49 100μM 23±0.2% ADC254 100μM 39±3.4% MMC-48 100μM 26±1.7% TM16 100μM 49±2.9% IP38 100μM 71±23.4% ADC265 100μM 63±2.7% TM19 100μM -32±28.6% TM20 100μM -3±5.8% LC77 100μM -26±2.1% SURAMINA 100μM -68±12.4%
Tabella 3 . Percentualedi attività su SIRT1 dei composti della SERIE 1.
Un peculiare sviluppo nell’ambito della serie 1, è rappresentato dalla molecola BB24, nella quale l’introduzione di un sostituente para-idrossifenilico in posizione 2 dell’anello A, comporta una profonda alterazione strutturale. In linea con questo sconvolgimento, BB24 è privo di qualsiasi attività stimolante ma apre, invece, ad un’interessante variazione dei parametri farmacocinetici, poiché è risultato un inibitore concentrazione-dipendente dell’enzima, e, alla massima dose testata, ha prodotto effetti quantitativamente paragonabili alla suramina.
Alla luce dell’interesse farmacologico anche verso gli inibitori dell’attività di SIRT1 (iSIRT1), questo profilo di BB24 dà spazio allo sviluppo di nuovi modelli di riferimento per inibitori originali.
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Grafico 3. Curva concentrazione-dipendente di BB24 confrontato con suramina 100 M.
L’effetto inibitorio di BB24 si manifesta non solo nei confronti del tono basale di attività dell’enzima, ma anche nei confronti di un’attività di SIRT1 stimolata dal resveratrolo. In particolare, l’attività di SIRT1 stimolata da resveratrolo, viene pressoché dimezzata dalla concomitante presenza di BB24, e la sua efficacia è ancora una volta paragonabile a quella prodotta dalla suramina.
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SERIE 2
Figura 37. Struttura chimica dei composti della SERIE 2.
Successivamente è stato apportato un ulteriore sviluppo strutturale di questi composti, mantenendo più o meno lo stesso pattern di sostituenti sui due anelli aromatici, con la variazione di un singolo aspetto strutturale, ovvero l’introduzione di un metile sul metilene della catena idrossiimminometilenica in posizione 3 dell’anello A (X= CH3 per tutti i composti della serie 2, esclusi RB29 e RB33). Questa modifica strutturale non porta a sostanziali variazioni dell’ attività su SIRT1, bensì conduce ad un peggioramento generalizzato degli effetti, a parità di sostituenti. Tale influenza negativa emerge chiaramente dal confronto fra le coppie di molecole strettamente analoghe, della serie 1 e 2:
TM16 vs LF15A
ADC265 vs IP31: si ha anche l’aggiunta di un metile in posizione 3 dell’anello B IP38 vs IP22
Viceversa, l’inserimento del gruppo trifluorometilico sulla catena idrossiimminometilenica in posizione 3 dell’anello A, sembra indurre un significativo cambiamento, infatti i composti BL29 e BL33 rivelano un’attività di stimolazione di SIRT1 decisamente superiore rispetto agli altri della serie 2, raggiungendo livelli di efficacia intorno al 70% (percentuale non influenzata dalla presenza dei sostituenti ossidrilici o metossilici sull’anello B) (Tabella 4).
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Grafico 5. Lettura spettrofluorimetrica dell’attività sull’enzima SIRT1 dei composti della SERIE 2, confrontati con resveratrolo (100%) e suramina.
Nome composto Attività massima %
RESVERATROLO 100μM 100±0.0% LF13 100μM -8±0.5% IP10 100μM 9±3.3% LF15A 100μM 29±1.7% IP31 100μM 10±5.1% IP15 100μM 6±12.3% IP22 100μM 2±8.5% IP16 100μM 31±4.9% BL29 100μM 70±5.4% BL33 100μM 66±17.0% SURAMINA 100μM -68±12.4%
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SERIE 3
Figura 38. Struttura chimica dei composti della SERIE 3.
Un ulteriore tentativo di sviluppo strutturale dei composti della prima serie è stato ottenuto con l’inversione delle posizioni reciproche dei sostituenti presenti sull’anello A (gruppo ossidrilico con la catena idrossiimminometilenica), ed inoltre, in tutti questi composti troviamo un sostituente in posizione 2 dell’anello A (generalmente un atomo di cloro, ad eccezione del composto RB28 che presenta un metile); pressoché tutti questi composti sono caratterizzati da un analogo pattern di sostituzione sull’anello B. Queste modifiche non portano benefici se non ad un peggioramento rispetto ai composti della serie 1. Prova ne è il fatto che il confronto con gli analoghi strutturali della serie 1, evidenzia la riduzione dell’attività stimolatoria su SIRT1.
Grafico 6. Lettura spettrofluorimetrica dell’attività sull’enzima SIRT1 dei composti della SERIE 3, confrontati con resveratrolo (100%) e suramina.
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ADC254 vs ADC132: introduzione, nel secondo composto, di un atomo di cloro in posizione 2 dell’anello A (come per il composto seguente della serie 3); TM16 vs LC9;
ADC254 vs RB28: inserimento, nel secondo composto, di un sostituente metilico in posizione 2 dell’anello A.
Il profilo farmacologico, alla stessa maniera, non cambia quando lasciamo l’atomo di cloro in posizione 2 dell’anello A ed introduciamo un metile a livello del metilene in posizione 3, i suddetti composti sono TM48, CG900 e TM53, che presentano inoltre un alogeno in posizione 3 dell’anello B (Tabella 5).
Nome composto Attività massima %
RESVERATROLO 100μM 100±0.0% ADC132 100μM -24±10.1% LC9 100μM 4±13.5% ADC280 100μM 37±13.1% TM48 100μM 25±11.2% CG900 100μM 8±12.9% TM53 100μM 28±13.2% SURAMINA 100μM -68±12.4%
Tabella 5. Percentualedi attività su SIRT1 dei composti della SERIE 3.
Unica eccezione è rappresentata da LP82, che porta un para-idrossi sostituente sull’anello B, nessuna modificazione della catena idrossiimminometilenica, ma che si diversifica per la presenza di un nitrile in posizione 2 dell’anello A. Testato alla concentrazione di 100 µM, LP82 porta a livelli apparenti di attività di circa un ordine di grandezza superiore al resveratrolo, tuttavia, nella misurazione dei suoi effetti, si sono riscontrati problemi sperimentali di flocculazione, e la sua colorazione (che potrebbe influire sulle letture clorimetriche sebbene gli esperimenti siano stati condotti “contro bianco”), che ci hanno fatto temere una errata interpretazione dei risultati. Di conseguenza abbiamo ridotto le concentrazioni di LP82 testate, sottoponendole ad uno studio più accurato.
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Grafico 7. Concentrazione dipendenza di LP82 confrontato a resveratrolo 100 µM (attività 100%).
Effettivamente abbiamo osservato che l’attività di questo composto è concentrazione- dipendente e concentrazioni nel basso ordine micromolare, portano ad una inibizione di SIRT1 con un’efficacia di circa 1.5 volte superiore al resveratrolo (LP82 3 µM). Ciò sembra fornire rilevanti aspetti per possibili ipotesi di relazione struttura-attività sull’importanza di una opportuna sostituzione in posizione 2 dell’anello A, che suggerirebbe di esplorare altri piccoli gruppi elettron-attrattori (come ad esempio i gruppi trifluorometilico e nitro).
SERIE 4
Sulla scorta delle informazioni sulle SAR emerse dalle prime serie sottoposte a valutazione farmacologica, è stata sviluppata la serie 4, formata da molti composti strutturalmente eterogenei (non mostrati per questioni di confidenzialità), serie nel cui ambito abbiamo osservato la presenza di composti tra cui emergono in modo netto i derivati ML13 e ML19 che raggiungono livelli di efficacia significativamente maggiore a quella del resveratrolo e con migliori livelli di potenza, che si collocano nel basso ordine micro molare (Grafico 9).
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Grafico 8. Lettura spettrofluorimetrica dell’attività sull’enzima SIRT1 dei composti della SERIE 4, confrontati con resveratrolo (100%) e suramina.
Grafico 9. Concentrazione-dipendenza di ML13 e ML19, confrontato a resveratrolo 100 µM (attività 100%)
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Questo ampio lavoro di screening iniziale teso a valutare l’efficacia attivante o inibente SIRT1 di diversi composti, ci ha consentito di individuare alcuni suoi nuovi attivatori (ML13, ML19, LP82) il cui profilo potrebbe giustificare futuri studi miranti a testare le attività anti-apoptotica o anti-aging, che si traducono in effetti più vasti nell’ambito dei sistemi cardio-vascolare e nervoso, nei confronti di insulti cellulari patologici (stress ossidativo, diabete e ischemia, per esempio), ma anche del deterioramento fisico legato al processo di invecchiamento.
Nome composto Attività massima %
RESVERATROLO 100μM 100±0.0% CG1223 100μM 21±16.0% CG1220B 100μM 12±6.3% CG1226 100μM -1±2.0% CG1224 100μM 7±3.2% CG1230 100μM -44±10.6% CG1229B 100μM 16±1.1% CG1235 100μM -16±3.8% CG1234 100μM -1±10.3% CG1233 100μM -130±7.6% CG1228 100μM -51±2.8% ML12 100μM 73±0.5% SURAMINA 100μM -68±12.4%
Tabella 6. Percentuale di attività su SIRT1 dei composti della SERIE 4.
D’altra parte ha consentito anche di identificare in BB24 un composto dotato di soddisfacente attività inibitoria dell’attività di SIRT1. Fra i vari eventuali impieghi, spicca la potenziale efficacia anti-tumorale riconosciuta agli inibitori di SIRT1. A questo proposito siamo ricorsi ad un primo test preliminare per valutare questo possibile approccio terapeutico. Sono state usate cellule di carcinoma pancreatico (della linea AsPC-1), tipologia tumorale nota per la sua particolare gravità, resistenza ad approcci farmacologici e sostanziale assenza di una terapia efficace (Grafico 10).
100
Grafico 10. Valutazione dell’attività anti-proliferativa in cellule tumorali AsPC-1.
Alla concentrazione di 100 µM, BB24 ha determinato una forte e significativa inibizione della proliferazione cellulare in cellule AsPC1 (concentrazioni inferiori non hanno prodotto alcun effetto significativo), suggerendo che la strategia farmacologica degli inibitori di SIRT1 può rappresentare un utile e promettente target per farmaci che, come BB24, possono essere destinati all’impiego in campo oncologico, come farmaco di prima linea, o più probabilmente come terapia di affiancamento a chemioterapie più consolidate.
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