Indice
Capitolo 1
Introduzione
... 11.1 Le sirtuine ... 1
1.2 Identificazione delle sirtuine ... 2
1.3 SIRT1 e gli organismi inferiori ... 3
1.4 Biochimica delle sirtuine ... 4
1.5 Le sette isoforme (SIRT1-SIRT7): localizzazione cellulare e funzione ... 6
1.6 SIRT1 ... 12
1.6.1 SIRT1 e le sue funzioni cellulari ... 15
1.6.2 SIRT1 e la regolazione della cromatina ... 18
1.6.3 SIRT1 e i telomeri ... 19
1.6.4 SIRT1 e i fattori di trascrizione... 21
1.6.5 Sirtuine, danno tissutale e riparazione ... 24
1.6.6 SIRT1 e le patologie metaboliche ... 25
1.6.7 SIRT1 e le patologie cardiovascolari ... 27
1.6.8 SIRT1 e le patologie neurodegenerative ... 34
1.6.9 SIRT1, fumo e consumo di alcool ... 37
1.6.10 SIRT1 e le variazioni circadiane ... 38
1.6.11 SIRT1 e il danno renale ... 39
1.7 Modulatori di SIRT1 ... 40
1.8 Polifenoli ... 43
1.8.1 Resveratrolo e i suoi effetti SIRT1-correlati ... 46
1.9 Composti non polifenolici ... 60
1.9.1 SRT1720 ... 61
1.10 Isonicotinammide ... 63
1.11 Metabolismo del NAD⁺ ... 64
1.12 Inibitori di SIRT1 ... 65
1.12.1 Splitomicina e derivati ... 66
1.12.2 Sirtinolo ... 66
1.12.4 Suramina ... 68
1.12.5 Tenovina ... 68
1.12.6 Salermide ... 69
1.12.7 Altri inibitori ... 69
Capitolo 2
Scopo della ricerca
... 71Capitolo 3
Materiali e metodi
... 733.1 Saggio enzimatico diretto ... 73
3.1.1 Soluzioni delle sostanze utilizzate ... 75
3.2 Esperimenti ... 76
3.2.1 Valutazione attività dei composti ... 76
3.2.2 Valutazione del composto BB24 in presenza di SIRT1 attivato ... 78
3.3 Materiale utilizzato per la sperimentazione in vitro ... 79
3.3.1 Colture cellulari ... 79
3.3.2 Mezzo di coltura ... 79
3.3.3 Sostanze e soluzioni tampone ... 80
3.3.4 Soluzioni delle sostanze utilizzate ... 80
3.4 Protocollo sperimentale ... 81
3.4.1 Scongelamento ... 81
3.4.2 Piastratura ... 81
3.5 Esperimenti ... 84
3.5.1 Effetto di BB24 sulla proliferazione cellulare ... 84
3.6 WST - 1 ... 84
3.7 Analisi dei dati ... 85
Capitolo 4
Risultati e discussione
... 871
Capitolo 1
Introduzione
1.1 Le sirtuine
Le sirtuine sono una classe di geni e di proteine correlate, recentemente scoperte, aventi un ruolo centrale nella regolazione dell’omeostasi metabolica/cellulare; il loro studio sta acquisendo interesse crescente per il potenziale terapeutico nei confronti di una molteplicità di stati fisiopatologici. Sono una famiglia di enzimi NAD⁺-dipendenti ad attività deacetilasica in grado di modulare proteine nucleari e citoplasmatiche che controllano importanti processi cellulari; alcune di loro presentano anche azione mono-ADP-ribosil-transferasica, demalonilasica e desuccinilasica.
L’acetilazione proteica è un meccanismo di modificazione post-traduzionale che regola funzioni cellulari cruciali quali le interazioni proteina-proteina, il mantenimento della loro stabilità ed attività [Kouzarides, 2000; Chang e Guarente, 2014]. Le reazioni di acetilazione e deacetilazione avvengono a livello del gruppo Ɛ-amminico di residui di lisina e sono catalizzate rispettivamente dagli enzimi istone-acetil-transferasi (HATs) e istone-deacetilasi (HDACs). La prima è correlata ad un’apertura della struttura della cromatina ed un’attivazione genica, mentre la seconda prevede l’idrolisi dei gruppi acetilici dai residui di lisina istonica, la condensazione cromatinica e l’interruzione della trascrizione. Esistono quattro classi di HDACs, Classi I-IV, individuate grazie all’analisi filogenetica condotta sulle proteine deacetilate correlate [Gregoretti et al., 2004]. Le sirtuine appartengono alle istone-deacetilasi di Classe III, omologhe del repressore trascrizionale Sir2, individuato nel lievito [Yang e Seto, 2007]. La maggior differenza funzionale fra questa famiglia di enzimi e le altre HDACs sta nel fatto che le Classi I, II e IV sono idrolasi zinco-dipendenti e vengono inibite dalla tricostatina A, mentre le sirtuine catalizzano la deacetilazione di substrati proteici in una reazione che consuma nicotinammide-adenin-dinucleotide (NAD⁺).
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1.2 Identificazione delle sirtuine
Lo studio delle sirtuine è iniziato con l’identificazione, negli organismi inferiori (Saccharomyces cerevisiae), del gene Sir2 (Silent Information Regulator 2), da cui prende il nome l’intera famiglia.
Da principio Sir2 venne classificato come appartenente al gruppo di proteine MAR1 (Mating-Type Regulator 1) (Figura 1), capaci di agire sulla repressione e/o attivazione genica. Fu scoperto dal team di Klar, in virtù di una mutazione spontanea che causava sterilità nel lievito, in risposta ad una riduzione del silenziamento dei loci genici
mating-type HMR e HML (rispettivamente acronimi di Homotallic Mat Right e Homotallic Mat Left) [Klar et al., 1979]. Una serie di mutazioni addizionali in un
fenotipo sterile furono scoperte contemporaneamente da Jasper Rine, che chiamò il set dei quattro geni responsabili, SIR (Silent Information Regulator) 1-4, nomenclatura che rimpiazzò quella MAT [Shore et al., 1984; Ivy et al., 1985; Rine e Herskowitz, 1987].
Figura 1. Struttura cristallografica del gene Sir2 di Saccharomyces Cerevisiae.
Dieci anni dopo questa scoperta iniziale, Gottlieb ed Esposito dimostrarono che Sir2 era l’unico gene del complesso SIR richiesto per sopprimere la ricombinazione tra le 100-200 copie codificanti RNA ribosomiale, ripetute in tandem nel cromosoma XII del lievito [Gottlieb ed Esposito, 1989]. Dal 1991, grazie soprattutto al lavoro di Gottschling e colleghi, fu riconosciuto il ruolo di Sir2 nel meccanismo del silenziamento genico, che
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avviene in prossimità dei telomeri [Aparicio et al., 1991]. Successivamente, notarono che le regioni silenti a livello dei telomeri e dei loci genici mating-type risultavano associate ad istoni relativamente ipoacetilati sul gruppo Ɛ-aminico dei residui di lisina N-terminali [Braunstein et al., 1993]. Infatti, una over-espressione di Sir2 causava una notevole deacetilazione degli istoni, ulteriore caratteristica che lo distingueva dagli altri geni appartenenti al complesso SIR. Nel 1995, in Saccharomyces cerevisiae vennero individuati altri quattro geni omologhi di Sir2, HST (homologues of SIR2) 1-4; nessuno di loro risultava essere essenziale ma erano complessivamente coinvolti nel silenziamento a livello dei loci mating-type e dei telomeri, così come nella progressione del ciclo cellulare e nel mantenimento dell’integrità genomica *Brachmann et al., 1995;
Derbyshire et al., 1996]. La scoperta degli omologhi di Sir2 nel lievito e poco dopo
anche nei batteri, nelle piante e nei mammiferi, dimostrò la sua appartenenza ad una grande ed antica famiglia di geni oggi chiamati “sirtuine”.
Le prime evidenze dell’attività enzimatica delle proteine correlate a questa classe di geni si ebbero sempre da studi condotti su Sir2. Utilizzando NAD⁺ marcato con =<P venne dimostrato che l’ortologo umano di Sir2 era in grado di trasferire il =<P dal NAD⁺ all’albumina di siero bovino, suggerendo il suo ruolo nel processo di mono-ADP-ribosilazione delle proteine [Frye, 1999+. L’attività deacetilasica delle sirtuine, invece, fu meglio caratterizzata a seguito di analisi molecolari sui residui di lisina di specifiche subunità istoniche [Imai et al., 2000; Landry et al., 2000; Smith et al., 2000]. Imai e colleghi analizzarono il prodotto della reazione di Sir2 attraverso HPLC e spettrometria di massa e, in aggiunta a dati ottenuti attraverso studi mutazionali su residui conservati del core, conclusero che l’attività deacetilasica NAD⁺-dipendente, piuttosto che quella mono-ADP-ribosil-transferasica, potesse chiarire le funzioni di Sir2 in vivo.
1.3 SIRT1 e gli organismi inferiori
In Saccharomyces cerevisiae, Sir2 è coinvolto nei processi cellulari legati all’invecchiamento (aging). L’accumulo esponenziale di rDNA circolare extracromosomiale (ERCs), che si ha con l’invecchiamento dell’organismo, è ritenuto essere il maggior determinante del lifespan (durata della vita) del lievito [Sinclair e
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sola introduzione di un singolo ERC in cellule giovani, è sufficiente per causare un invecchiamento prematuro.
Anche se il meccanismo attraverso il quale ERCs influenza il lifespan non è ancora del tutto chiaro, differenti manipolazioni a livello genico suggeriscono che questo accumulo sia correlato negativamente al fenomeno di aging nel lievito [Sinclair e
Guarente, 1997; Defossez et al., 1999; Kaeberlein et al., 1999]. Da principio si pensava
che l’azione di Sir2 sull’estensione del lifespan di Saccharomyces cerevisiae fosse una conseguenza della sua attività silenziante su ERCs; tuttavia i suoi effetti sull’invecchiamento vanno oltre questo silenziamento poiché manipolazioni genetiche sui suoi ortologhi possono influenzare anche il lifespan di organismi eucariotici superiori, quali il nematode Caenorhabditis elegans [Tissenbaum e Guarente, 2001;
Viswanathan et al., 2005; Berdichevsky et al., 2006; Rizki et al., 2011], ed insetti come
il moscerino della frutta Drosophila melanogaster [Rogina e Helfand, 2004; Bauer et
al., 2009], nei quali si ritiene che un accumulo di ERCs non causi invecchiamento. Da
alcuni studi emerge che gli effetti di Sir2 (e dei suoi ortologhi) sul lifespan degli organismi possono essere indiretti oppure regolati da modulatori specifici [Kaeberlein
e Powers, 2007; Burnett et al., 2011; Lombard et al., 2011; Viswanathan e Guarente, 2011].
Se non agisce primariamente come determinante del lifespan, qual è il ruolo esatto di questa famiglia di proteine?
Un primo indizio sulla reale funzione di Sir2, o dei suoi ortologhi, fu ottenuto nel momento in cui la sua attività come enzima ‘silenziantÈ fu definita precisamente come deacetilasi NAD⁺-dipendente [Imai et al., 2000+. La dipendenza dal NAD⁺ e la relativamente alta Km dell’enzima Sir2 per NAD⁺, suggeriscono immediatamente una potenziale connessione tra l’attività di Sir2 e lo stato metabolico della cellula [Guarente, 2000]. Inoltre, queste proteine regolano altri importanti processi cellulari, quali il ciclo cellulare, l’apoptosi e l’infiammazione.
1.4 Biochimica delle sirtuine
Dai lieviti all’uomo, la classe delle sirtuine presenta un dominio centrale catalitico altamente conservato, costituito da 275 aminoacidi, e le estensioni delle estremità N-
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e C-terminali variabili in lunghezza e sequenza, caratteristica che può influenzare il legame con modulatori, mediare l’interazione con altre isoforme dell’enzima e determinare la localizzazione cellulare (Figura 2) [Dali-Youcef et al., 2007; Michan e
Sinclair, 2007].
Figura 2. Domini delle sette sirtuine umane.
Nei mammiferi sono stati individuati ortologhi del gene Sir2, corrispondenti alle sette isoforme di sirtuina (SIRT1-SIRT7), contraddistinte per distribuzione all’interno della cellula e per funzione.
Le sirtuine, ubiquitariamente espresse, accoppiano la deacetilazione di un residuo di lisina all’idrolisi di una molecola di NAD⁺, tramite il trasferimento del gruppo acetile all’ADP-ribosio per formare 2’-O-acetil-ADP-ribosio e nicotinammide (NAM) (Figura 3) [Haigis et al., 2006].
NAD⁺ è un coenzima implicato in diverse funzioni biologiche, nelle reazioni di ossido-riduzione, nella riparazione del DNA, nelle reazioni di ADP-ribosilazione, nella risposta immunitaria e nella regolazione trascrizionale.
Oltre ad esser influenzata dal rapporto NAD⁺/NADH all’interno della cellula (ne determina lo stato nutrizionale), la reazione di deacetilazione è regolata anche da uno dei suoi prodotti, nicotinammide, che è un inibitore non competitivo delle sirtuine.
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L’altro prodotto, il 2’-O-acetil-ADP-ribosio, sembra invece facilitare la formazione e il silenziamento dell’eterocromatina, regolare i canali ionici e modulare lo stato redox cellulare [Denu, 2005+. Alcune sirtuine non esibiscono un’attività deacetilasica, ma agiscono come mono-ADP-ribosiltransferasi, catalizzando il trasferimento del gruppo ADP-ribosio dal NAD⁺ a proteine accettrici, in una modificazione post-traduzionale chiamata ADP-ribosilazione e, similmente alle reazioni di deacetilazione, viene rilasciata nicotinammide [Houtkooper et al., 2012].
Questi enzimi hanno un ruolo chiave nella regolazione di molti aspetti del metabolismo cellulare, da quello energetico a quello di sintesi, modulano la trascrivibilità genica della cromatina e regolano l’attività di diversi fattori trascrizionali, quali p53, NF-kB, PGC-1α, FOXO e HSF-1.
Nel tempo hanno guadagnato una notevole attenzione in campo medico anche grazie al loro ruolo di sensori metabolici e di mediatori della sopravvivenza cellulare in condizioni di stress, come ad esempio la restrizione calorica e l’esercizio fisico, nelle quali la loro trascrizione risulta attivata.
FIgura 3.Reazione di deacetilazione SIRT1-dipendente su residui di lisina.
1.5 Le sette isoforme (SIRT1-SIRT7): localizzazione cellulare e funzione
Sebbene ogni isoforma dell’enzima sia codificata da un gene SIRT specifico, l’espressione e l’attività nei vari tessuti sono fortemente influenzate dalle variazioni ambientali, dalla dieta e dallo stile di vita (Figura 4).
Fra tutte, SIRT1 è l’isoforma più caratterizzata e studiata, è localizzata principalmente nel nucleo [Michishita et al., 2005] ma può anche traslocare nel citoplasma [Tanno et
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al., 2007], dove sono stati individuati alcuni suoi target. Approfondiremo in seguito
quali sono le sue implicazioni nel metabolismo cellulare in condizioni fisiologiche e patologiche.
SIRT2 è l’ortologo umano del gene Hst2 di Saccharomyces cerevisae ed è prevalentemente situata nel citoplasma. È importante la sua attività deacetilante sulle molecole di α-tubulina [North et al., 2003]. Caratteristica di SIRT2 è la sua migrazione nel nucleo, durante la transizione G₂/M del ciclo cellulare, per modulare la condensazione della cromatina attraverso la deacetilazione dell’istone H₄ *Vaquero et
al., 2006]. Può, inoltre, deacetilare FOXO1 e promuovere il suo legame con PPARγ, con
il risultato di sopprimere l’attività di quest’ultima e quindi la differenzazione degli adipociti [Wang e Tong, 2009+. Deacetila anche FOXO3A per promuovere l’espressione ed il rilascio di molecole antiossidanti e pro-apoptotiche in situazioni di stress cellulare [Wang et al.,2007]. Un recente studio ha evidenziato che in risposta a stimoli ossidativi extra-cellulari, si ha una riduzione SIRT2-dipendente dell’acetilazione della glucosio-6-fosfato-deidrogenasi, enzima chiave del ciclo del pentoso fosfato [Wang et al., 2014]. SIRT2 è anche implicato in una serie di patologie, quali il cancro e le malattie neurodegenerative come il Parkinson e il morbo di Huntington [De Oliveira et al.,
2012].
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SIRT3 si ritrova generalmente nel mitocondrio e anche questa isoforma è prevalentemente una deactilasi NAD⁺-dipendente. Viene attivata a seguito del distacco dalla matrice mitocondriale per mezzo di una peptidasi [Schwer et al., 2002]. È altamente espressa in tessuti ricchi di mitocondri ed interviene nel processo di termogenesi del tessuto adiposo bruno [Lombard et al., 2007; Shi et al., 2005]. Coerentemente con la sua localizzazione cellulare, un diminuzione di SIRT3 in modelli animali (mouse model) causa un marcato aumento dell’acetilazione delle lisine mitocondriali [Lombard et al., 2007]. Una ridotta espressione di SIRT3 può risultare da un calo dei livelli di ATP nei diversi organi, da una iperacetilazione del complesso I mitocondriale e dal decremento della sua attività [Ahn et al., 2008]. Il primo substrato di SIRT3 ad essere identificato è stato l’enzima mitocondriale acetil-CoA-sintetasi-2, attivato a seguito della sua deacetilazione per mezzo della sirtuina [Schwer et al.,
2006]. Nei cardiomiociti SIRT3 agisce in dipendenza dello stress cellulare, e attraverso
la deacetilazione di Ku70, ne favorisce l’interazione con la proteina pro-apoptotica Bax, prevenendo in tal modo la sua traslocazione nel mitocondrio [Sundaresan et al., 2008]. SIRT3 interagisce anche con la proteina del complesso I NDUFA9 [Ahn et al., 2008]. Rilevante è la deacetilazione a carico degli enzimi superossido-dismutasi (SOD2) e isocitrato-deidrogenasi (IDH2) mitocondriali, reazione che ne migliora l’attività ossido-riduttiva nel prevenire l’accumulo delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), tossiche per la cellula. Regolando la produzione di ROS, SIRT3 reprime l’attività trascrizionale del fattore indotto dall’ipossia (HIF-1α) e quindi potrebbe potenzialmente agire come soppressore tumorale [Bell et al.,2011+. Questa proteina stimola l’ossidazione degli acidi grassi mitocondriali per mezzo della deacetilaziome dell’acil-CoA-deidrogenasi a catena lunga, enzima chiave coinvolto nell’ossidazione di substrati a lunga catena [Hirschey et al., 2010]. Da studi recenti sembra che un composto bi fenolico naturalepolifenolo naturale, l’Honokiol, blocchi l’ipertrofia cardiaca nei topi, agendo tramite un’attivazione di SIRT3 [Pillai et al., 2015]. Concludendo, emerge il ruolo dell’isoforma SIRT3 nel mantenimento dell’omeostasi mitocondriale (Figura 5).
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Figura 5. Il ruolo cardioprotettivo di SIRT3.
SIRT4 è anch’essa localizzata nel mitocondrio e presenta attività ADP-ribosil-transferasica NAD⁺-dipendente. La secrezione di insulina dalle cellule β del pancreas è modulata da questa isoforma, così come il rilascio dei granuli contenenti insulina è innescato dalla concentrazione locale di ATP, regolata da enzimi quali la glutammato-deidrogenasi (GDH) che vengono inibiti dalla ADP-ribosilazione operata da SIRT4 [Haigis et al., 2006]. Altra importante funzione è il controllo regolatorio sul metabolismo della glutamina per facilitare la risposta in caso di danni al DNA e per prevenire l’insorgenza di tumori *Jeong et al., 2013]. Differentemente la via di mTORC1, attivata durante la proliferazione delle cellule tumorali, provoca down
regulation dell’espressione di SIRT4 *Csibi et al., 2013+. L’attività deacetilante di questa
proteina interviene nel mantenimento dell’omeostasi dei lipidi a livello epatico [Laurent et al., 2013]; è recentemente emerso che presenta funzione lipoamidasica inibente l’attività della piruvato-deidrogenasi, enzima che collega glicolisi e ciclo dell’acido citrico *Mathias et al., 2014]. Questi studi evidenziano il ruolo di SIRT4 nella regolazione del metabolismo cellulare e possibilmente nella prevenzione dei tumori.
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SIRT5 si trova nel mitocondrio ed è una proteina NAD⁺-dipendente lisina demalonilasi, desuccinilasi [Du et al., 2011] e deglutarilasi [Tan et al., 2014]. Ha un ruolo centrale nel diminuire la concentrazione di ammoniaca, tramite la deacetilazione dell’enzima carbamoil-fosfato-sintetasi-1 (CPS1), nella tappa limitante del ciclo dell’urea. Infatti, studi condotti su topi knockout per il gene SIRT5, hanno dimostrato livelli di ammoniaca più elevati nel sangue durante i pasti oppure in diete iperproteiche [Nakagawa et al., 2009+. CPS1 risulta essere anche un target dell’attività de-succinilasica/de-succinilazione e de-glutarilasica operata da SIRT5. Altri target di questa sirtuina sono SOD1 [Lin et al., 2013] e la urato-ossidasi (o uricasi) mitocondriale [Nakamura et al., 2012].
Da poco si è scoperto il suo ruolo nella reazione di desuccinilazione di importanti enzimi ossidanti gli acidi grassi e nella promozione della loro ossidazione [Zhang et al.,
2015]. Sebbene una perdita di SIRT5 conduca ad ipersuccinilazione di alcune
componenti cellulari, questo enzima è considerato una isoforma indispensabile in termini di regolazione metabolica [Rardin et al., 2013; Yu et al., 2013].
SIRT6 è situato nel nucleo (eterocromatina) e la sua attività enzimatica include la deacetilazione degli istoni, l’ADP-ribosilazione e la lisin-deacilasi. Mediante la lisina-deacilasi del fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), promuove la sua secrezione dai macrofagi [Jiang et al., 2013].
È cruciale nel mantenimento dell’integrità genomica e nella riparazione dei danni al DNA attraverso differenti meccanismi. Ha effetti rilevanti sul metabolismo del glucosio tramite la soppressione dell’espressione di HIF-1α e di altri geni glicolitici *Zhong et al.,
2010]. Quindi una diminuzione di SIRT6 si ha in stati di ipoglicemia severa causata
dall’aumento dell’uptake del glucosio nei muscoli e nel tessuto adiposo. Esercita anche un controllo sulla gluconeogenesi a livello epatico, regolando indirettamente l’acetilazione di PGC-1α, attraverso la modificazione dell’attività enzimatica dell’acetil-transferasi GCN5 [Dominy Jr et al., 2013].
In più, SIRT6 è coinvolto nel metabolismo lipidico regolando negativamente la sintesi di trigliceridi [Kim et al., 2010+. Come per SIRT1, l’espressione di SIRT6 è correlata con la longevità cellulare e diminuisce con l’avanzare dell’età nei fibroblasti dermici umani
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[Sharma et al., 2013], mentre una sua over-espressione estende il lifespan in topi maschi [Kanfi et al., 2012].
Troviamo un suo coinvolgimento anche in alcuni tipi di tumore [Kugel e Mostoslavsky,
2013+. Nell’insieme, questi studi confermano un ruolo prominente di SIRT6 nel
metabolismo e nell’invecchiamento.
SIRT7 è espresso nel nucleolo, dove interagisce con gli istoni e la RNA-polimerasi I, regolando positivamente la trascrizione del rDNA [Ford et al., 2013]. È fosforilato durante la mitosi quando la trascrizione di rDNA viene interrotta e subisce defosforilazione ed altri cambiamenti conformazionali per poi riprendere con la trascrizione, una volta terminata la fase M [Grob et al., 2008+. L’attività di SIRT7 non è ancora stata ben definita; inizialmente si pensò che potesse avere un’azione anti-proliferativa, riscontrata in linee cellulari murine [Vakhrusheva et al., 2008], ma, in netto contrasto con questa ipotesi, venne dimostrato che questo enzima deacetilava e reprimeva la trascrizione di geni correlati con la soppressione tumorale, perpetuando così la trasformazione oncogena [Barber et al., 2012]. Successivamente, il suo potenziale antitumorale fu infine messo in evidenza nell’epatocarcinoma e nel cancro del colon-retto umani [Kim et al., 2013; Yu et al., 2014]. Altre funzioni importanti di SIRT7 includono il suo ruolo nella biogenesi dei ribosomi, nella sintesi delle proteine [Tsai et al., 2014+ e nell’inibizione di HIF-1α e HIF-2α *Hubbi et al., 2013]; è un cofattore nella repressione della trascrizione di Myc [Shin et al., 2013] ed interviene nel metabolismo epatico [Yoshizawa et al., 2014]. Uno studio recente riporta la sua influenza positiva sul mantenimento dell’omeostasi mitocondriale, per mezzo dell’acetilazione di GABPβ1, regolatore principale della codifica nucleare di geni mitocondriali [Ryu et al., 2014].
SIRT7 è quindi considerato un potenziale target nella terapia tumorale e studi continuano per individuare altri eventuali sue attività.
È interessante supporre che lo spettro d’azione delle sirtuine non sia solamente limitato alla reazione di deacetilazione ma che possa coprire in toto il range delle modifiche post-traduzionali basate sul fenomeno dell’acetilazione. L’identificazione dei substrati delle sirtuine, negli ultimi anni, ha chiaramente messo in evidenza il loro ruolo prominente come regolatrici del metabolismo (Tabella 1).
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Tabella 1. Localizzazione cellulare, attività ed effetti sulle patologie delle sette sirtuine.
1.6 SIRT1
Tra le sette sirtuine, SIRT1 è quella meglio descritta ed è l’isoforma umana che presenta più analogie con Sir2 del Saccharomyces cerevisiae.
La SIRT1 umana presenta la porzione conservata del core catalitico comune a tutte le sirtuine ed entrambe le estensioni dei domini N- e C-terminali, comprendenti in totale circa 240 aminoacidi. Queste estensioni servono da piattaforme per l’interazione con proteine regolatrici e con substrati. È costituita complessivamente da 747 aminoacidi, contiene due segnali di localizzazione nucleare (NLS) e due segnali di esportazione nucleare (NES). La bilanciata funzionalità di questi segnali determina la presenza di SIRT1 sia nel compartimento nucleare che in quello citoplasmatico, e spiega perché la sua localizzazione può differire a seconda del tipo di cellula o del tessuto presi in considerazione e in risposta a particolari condizioni fisiologiche o stimolazioni.
Per esempio, nonostante SIRT1 si trovi principalmente nel nucleo delle cellule COS7 [McBurney et al., 2003; Sakamoto et al., 2004], è invece abbondantemente espresso nel citosol delle cellule β pancreatiche, nei miotubi e nei cardiomiociti dei roditori [Moynihan et al., 2005]. Sebbene le implicazioni e la regolazione del trasporto di SIRT1 siano ancora largamente sconosciute, alcuni esperimenti indicano che la sua
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traslocazione dal nucleo al citosol avvenga subito dopo l’inibizione della segnalazione insulinica [Tanno et al., 2007+. Quest’ultima osservazione suggerisce una connessione tra l’attività di SIRT1 e la percezione dello stato metabolico della cellula.
L’attività di SIRT1 è generalmente incrementata in situazioni di stress energetico e nutrizionale. Il fatto che l’attività di SIRT1 sia regolata da NAD⁺, conferma l’ipotesi che NAD⁺ possa agire come sensore metabolico in situazioni di stress energetico, condizioni che influenzano i suoi livelli. Alcuni aspetti di questa ipotesi mostrano ancora delle controversie. Primo tra loro è se l’attività della sirtuina possa realmente rispondere ai cambiamenti dei livelli intracellulari di NAD⁺. È necessario fare una premessa, la Km delle sirtuine per il NAD⁺ cade nel range fisiologico della biodisponibilità di NAD⁺. Nella maggior parte dei casi, evidenze sperimentali dirette a supporto di questa tesi sono preliminari o assenti. In gran parte, questo accade perché i reali livelli di biodisponibilità di NAD⁺ sono difficilmente valutabili. L’intervallo stimato del contenuto intracellulare di NAD⁺ totale è compreso fra 0.2-0.5 mM, che si trova all’interno dei valori stimati di Km di SIRT1 per NAD⁺. Questo sta a significare che NAD⁺ potrebbe essere un agente limitante (rate-limitng) in determinate circostanze per spingere SIRT1 alla sua massima attività. Non viene distinto il NAD⁺ libero da quello legato a proteine; questa approssimazione non tiene conto dell’esistenza della compartimentalizzazione cellulare del NAD⁺.
In generale, nei tessuti di mammifero i livelli di NAD⁺ aumentano (raramente si assiste ad un’aumento superiore al doppio della concentrazione fisiologica di NAD⁺) in risposta a stress energietici/nutritizionali, come ad esempio l’esercizio fisico *Cantò et
al., 2009; Costford et al., 2010], il digiuno [Rodgers et al., 2005 Cantò et al., 2010], o la
restrizione calorica [Chen et al., 2008+. Di conseguenza, l’attività di SIRT1 risulta migliorata da tutte queste condizioni. Interessante osservare che le fluttuazioni dei livelli di NAD⁺ sembrano essere circadiano-dipendenti [Nakahata et al., 2009; Ramsey
et al., 2009+. L’influenza di SIRT1 sul controllo clock-related dell’espressione genica
[Asher et al., 2008; Nakahata et al., 2008] apre scenari attraenti in cui poter osservare questa relazione come una possibile influenza dei cicli nutrimento/digiuno sul ritmo circadiano. In generale, l’alto tasso glicemico durante la fase di nutrizione può portare ad una più alta riduzione dei livelli di NAD⁺, mentre il suo abbassamento negli stati di
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digiuno sembra migliorare il metabolismo ossidativo mitocondriale, derivante dall’ossidazione degli acidi grassi, che è generalmente accoppiato con un aumento dei livelli di NAD⁺. Queste osservazioni costituiscono un interessante meccanismo secondo cui il metabolismo sarebbe direttamente accoppiato all’attività enzimatica di SIRT1. L’attività di SIRT1 è controllata anche da altri metaboliti NAD⁺-derivati. È stato ipotizzato che NADH possa competere con NAD⁺ per il legame con SIRT1 e possa inibire l’attività dell’enzima *Lin et al., 2004], anche se NADH può inibire competitivamente il legame di NAD⁺ solamente nel range del millimolare, che è ben sopra i suoi livelli fisiologici [Schmidt et al., 2004]. Un maggior e più consistente effetto inibitorio è raggiunto con NAM, che esercita una potente inibizione irreversibile sull’attività di SIRT1 in maniera non-competitiva con NAD⁺ *Bitterman et al., 2002; Anderson et al.,
2003]. Studi di cinetica dimostrano che NAM agisce con una Km compresa tra 30 e 200
µM [Bitterman et al., 2002]. I valori di riferimento per la concentrazione intracellulare e la compartimentalizzazione subcellulare di NAM sono ancora lontani dall’essere determinati, argomento ulteriormente complicato dalla sua natura diffusiva [van
Roermund et al., 1995] (Figura 6).
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Evidenze indirette della larga influenza di NAM su SIRT1 ci arrivano da esperimenti di manipolazione sul suo metabolismo attraverso il cambiamento dell’attività di nicotinammide-fosforibosiltrasferasi (Nampt). Nella cellula, NAM è usato come substrato per la ri-sintesi di NAD⁺ attraverso l’azione di Nampt. L’inibizione o il
downstream di Nampt conduce ad un accumulo di NAM e alla deplezione di NAD⁺, ed
in ultimo al decremento dell’attività di SIRT1 *Revollo et al., 2004]. Questo sottolinea come NAM possa influenzare l’attività di SIRT1 attraverso diversi meccanismi: primo, come un inibitore non-competitivo di SIRT1, e secondo, come un precursore di NAD⁺. Bassi livelli di NAM possono perciò essere di beneficio per l’attività di SIRT1, perché NAM può agire da precursore di NAD⁺, ma, più importante, l’accumulo di NAM ottenuto per inibizione di SIRT1 può essere deleterio [Yang e Sauve, 2006].
1.6.1 SIRT1 e le sue funzioni cellulari
L’enzima SIRT1, in accordo con la sua localizzazione cellulare duale, presenta target sia a livello nucleare che citosolico. Interagisce e deacetila istoni e un elevato numero di substrati non-istonici (Figura 7). Questa sirtuina deacetila preferenzialmente specifici residui nelle subunità istoniche, quali la lisina 16 dell’istone 4 (H4K16), H3K9, H3K56 [Das et al., 2009] e H1K26, necessari per promuovere la formazione dell’eterocromatina ed il silenziamento trascrizionale [Vaquero et al., 2004; Vaquero et
al., 2007]. Tra i substrati proteici non-istonici di SIRT1 troviamo il soppressore tumorale
p53, il fattore nucleare κB (NF-κB), PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor
gamma coactivator 1-alpha), i fattori di trascrizione FOXO (fork-head box protein O), il
recettore degli ossisteroli (LXR), PARP, Ku70, il fattore inducibile l’ipossia (HIF-1α) e molti altri ancora [Frye et al., 2004; Lim et al., 2010; Dioum et al., 2009; Li et al., 2007;
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Figura 7. SIRT1, regolazione funzioni fisiologiche.
SIRT1 ha un ruolo predominante nella regolazione dell’apoptosi, attraverso la deacetilazione di p53 ed inibendo la trascrizione p53-dipendente durante lo stress cellulare [Vaziri et al., 2001; Cheng et al., 2003; Luo et al., 2001]. Controlla anche il processo infiammatorio deacetilando la subunità p65 del complesso NF-κB ed inibendo così la cascata di segnali ad esso relazionata. Al contrario, questo fattore di trascrizione opera una diminuzione dell’attività di SIRT1 modulando l’espressione di miR-34a, IFNγ e di ROS [Kauppinen et al., 2013]. miR-34a, un soppressore tumorale, si lega direttamente a 3’-UTR di SIRT1, reprimendo in tal modo la sua espressione ed aumentando l’apoptosi p53-mediata (miR-34a è esso stesso un target trascrizionale di p53) [Yamakuchi et al., 2008; Bommer et al., 2007]. In più, Kim e colleghi dimostrarono
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che p53 interviene nella repressione miR-34a-mediata di SIRT1 nella citotossicità indotta da cisplatino [Kim et al., 2014].
L’antagonismo tra SIRT1 e la via di trasduzione di NF-κB è evidente in molte patologie infiammatorie e nell’aging [Zhang et al., 2010; Schug et al., 2010+. L’infiammazione associata ad un aumento della produzione di ossido nitrico (NO) risulta dalla S-nitrosilazione e dall’inibizione dell’attività di SIRT1, eventi che aumentano ulteriormente la risposta infiammatoria attraverso un incremento dell’acetilazione di p65. SIRT1 ha dimostrato di possedere anche un’azione anti-tumorale, in studi condotti su roditori, che probabilmente è legata alla sua abilità nel deacetilare ed inibire l’attività trascrizionale della beta-catenina [Kabra et al., 2009; Firestein et al.,
2008].
SIRT1 ha un ruolo principale nella regolazione del metabolismo e, importante in questo processo, è la deacetilazione di PGC-1α. Sembra che la sirtuina epatica sia implicata nel metabolismo dei lipidi e del glucosio durante i pasti [Rodgers e Puigserver, 2007]. È vitale nel mantenere l’omeostasi lipidica attraverso la β-ossidazione degli acidi grassi nel fegato, mediata da PPARα *Purushotham et al., 2009], e nel mobilizzare i grassi dagli adipociti bianchi durante le fasi di nutrizione [Picard et al., 2004]. Inoltre, questo enzima controlla la biogenesi mitocondriale regolando il pathway di PGC-1α *Nemoto
et al., 2005]. Regola negativamente l’espressione e la fosforilazione del trasduttore del
segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) e la sua implicazione nella respirazione cellulare [Bernier et al., 2011].
Un aspetto interessante del controllo metabolico SIRT1-mediato è il suo esser regolato da AMPK (proteina chinasi attivata da AMP), sensore energetico della cellula. L’attivazione di AMPK determina un miglioramento dell’attività di SIRT1 attraverso l’incremento dei livelli del NAD⁺ residuo, derivante dalla sua idrolisi accoppiata alla deacetilazione dei target di SIRT1 [Canto et al., 2009+. Viceversa, l’attivazione di SIRT1 induce anche quella di AMPK mediante la deacetilazione della chinasi LKB1. Le adipochine, come l’adiponectina, hanno mostrato di essere stimolanti nei confronti del
pathway AMPK-SIRT1-PGC-1α e nell’arricchire il contenuto mitocondriale dei miociti
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positiva sulla secrezione di insulina dalle cellule β-pancreatiche, stimolata dalla repressione del gene della proteina disaccoppiante 2 (UCP2) [Bordone et al., 2006]. La sua localizzazione e/o la sua attività enzimatica sono regolate da alcune modifiche post-traduzionali come la fosforilazione, la SUMOilazione (si indica con questo nome il legame covalente fra gli istoni e una famiglia di piccole proteine -Small
Ubiquitin-like Modifier, SUMO -) distaccatesi da altre molecole proteiche; anche questo tipo di
legame comporta modificazioni funzionali dei geni interessati, la S-nitrosilazione e la carbonilazione [Shinozaki et al., 2014; Nasrin et al., 2009; Tong et al., 2013; Gu et al.,
2013].
I ruoli pleiotropici di SIRT1 nelle cellule fanno di questo enzima un essenziale marker proteico sia nell’invecchiamento sia in differenti patologie, quali quelle cardiovascolari, neurodegenerative, tra le quali il diabete, il cancro e in altre circostanze, sia fisiologiche che non [Nakagawa e Guarente, 2011].
1.6.2 SIRT1 e la regolazione della cromatina
Negli eucarioti la regolazione dell’espressione genica avviene mediante meccanismi di compattamento e decompattamento della cromatina nucleare, la quale, nella sua forma compatta, eterocromatina, ha un effetto repressivo sulla trascrizione genica. Pertanto, l’attivazione dell’espressione genica richiede il decompattamento della cromatina, eucromatina, che è in parte mediato da riarrangiamenti post-trascrizionali delle code N-terminali degli istoni mediante reazioni di acetilazione e ubiquitinazione delle lisine, di metilazione delle lisine e delle arginine, o di fosforilazione delle serine e probabilmente delle treonine.
Tutte queste modifiche (tranne le metilazioni) rendono più negativa la carica elettrica delle catene laterali interessate, quindi indeboliscono le interazioni tra istoni e DNA, favorendo la decondensazione dell’eterocromatina. Al contrario, i gruppi metilici aumentano la basicità e l’idrofobicità delle catene a cui sono legati, quindi tendono a stabilizzare la struttura.
L’acetilazione è un processo reversibile catalizzato dagli enzimi HATs (istone-acetil-transferasi) che, trasferendo il gruppo acetile dall’acetil-coenzima A ai residui di lisina presenti nelle code N-terminali degli istoni, determinano il decompattamento della
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cromatina e quindi la formazione di una struttura trascrizionalmente permissiva. La deacetilazione, invece, è catalizzata dagli enzimi HDACs (istone-deacetilasi) che, aumentando l’interazione DNA-istoni e istone-istone, inducono un maggiore compattamento della cromatina e quindi generano una struttura trascrizionalmente inattiva. SIRT1 è quindi in grado di deacetilare i residui di lisina dei domini N- terminali, reprimendo l’attività dei geni legati al ciclo cellulare e al differenziamento e favorendo così la riformazione dell’eterocromatina (Figura 8) *Ceolotto, 2012].
Figura 8.Categorie di targets di SIRT1 per la deacetilazione e patologie correlate.
1.6.3 SIRT1 e i telomeri
I telomeri sono strutture costituite da DNA e proteine, poste all’estremità dei cromosomi, formati da piccole sequenze nucleotidiche ripetute in tandem (5'-TTAGGG-3' nell'uomo). I telomeri variano in lunghezza, da poche decine a decine di migliaia di coppie di basi e rappresentano regioni del DNA non codificanti.
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La loro importanza risiede nella capacità di dare stabilità al DNA, evitando che i cromosomi si avvolgano su se stessi o si ricombinino in corrispondenza delle estremità. In quest’ultimo caso, si verrebbero a creare lunghi cromosomi con due centromeri, che tenderebbero ad impacchettarsi e, non potendo più andare incontro ad eventi mitotici, condurrebbero alla morte cellulare. Il telomero ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi, poiché la DNA-polimerasi non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione. Ad ogni duplicazione del DNA e alla conseguente divisione cellulare, i telomeri vanno incontro pertanto ad un progressivo accorciamento, ma la loro lunghezza originaria viene ristabilita grazie all’intervento di un importante enzima, denominato telomerasi. Tale enzima non è sempre funzionante: nell’uomo, la telomerasi è attiva soltanto durante lo sviluppo embrionale, nelle cellule staminali e nella linea germinale dell’adulto; in tutte le altre cellule, la lunghezza dei telomeri, in mancanza di telomerasi, si riduce progressivamente dopo ogni divisione cellulare. Si stima che ad ogni ciclo replicativo i telomeri si accorcino di 50÷200 paia di basi. Quando viene raggiunta una lunghezza telomerica minima critica, si attivano segnali cellulari che inducono le cellule ad entrare in senescenza replicativa, ovvero in una fase di arresto permanente della proliferazione cellulare. Le cellule senescenti, rimangono attive metabolicamente, ma la loro espressione genica è alterata e di conseguenza anche i loro cicli di divisione rallentano.
Diverse ricerche sono state condotte per evidenziare la correlazione tra attività telomerasica ed invecchiamento. A tal fine è stata modificata in laboratorio la lunghezza dei telomeri di cromosomi appartenenti a cellule di individui d'età compresa tra 0 – 93 anni (attraverso l’utilizzo di nucleasi).
I risultati di tali esperimenti mostrarono, chiaramente, una relazione tra attività proliferativa ed età. La proliferazione è normalmente maggiore nelle cellule d’individui giovani, ma la cosa sorprendente, è stata sicuramente la dimostrazione della correlazione tra capacità replicativa e lunghezza telomerica, valida per l’intero intervallo d’età dei soggetti. Ciò stava ad indicare che le cellule con telomeri accorciati, sperimentalmente, si replicavano meno rispetto a quelle coi telomeri più lunghi [Pompella, 2013].
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Queste osservazioni si schierano a supporto dell’ipotesi che la lunghezza telomerica sia un biomarker per l’invecchiamento delle cellule somatiche umane. Infatti, accorciandosi ad ogni divisione cellulare, i telomeri si comportano come veri e propri “orologi molecolari“, indicando il numero di volte che la cellula si è divisa.
Oggi molti laboratori di ricerca stanno investigando su come poter “resettare” l’orologio biologico, al fine di ottenere il mantenimento delle estremità cromosomiche nelle cellule eucariotiche e rallentare quindi i processi di invecchiamento. In questo contesto si inseriscono molti studi che evidenziano come l’espressione di SIRT1 possa preservare l’integrità del genoma e la sua stabilità. Tra questi, uno in particolare ha dimostrato come SIRT1 possa avere un impatto sul mantenimento della lunghezza dei telomeri, analizzando sia la perdita di funzione di SIRT1 (SIRT1 -/- mice), sia l’aumento di funzione, utilizzando topi con una over-espressione di SIRT1 (SIRT1 super mice) [Sabatini, 2006].
L’over-espressione di SIRT1 nei topi porta ad una diminuzione della percentuale di erosione dei telomeri associata alla divisione cellulare e all’invecchiamento tissutale, mentre la delezione di SIRT1 porta ad un effetto opposto. Gli effetti benefici di SIRT1 sulla lunghezza dei telomeri si manifestano senza nessun effetto negativo sull’integrità degli stessi; questi risultati sono stati confermati da altri studi, in cui vengono evidenziati anche gli effetti benefici della sirtuina sull’attività della telomerasi e sulla risposta al danno al DNA. Infatti, la delezione di SIRT1 provoca una notevole diminuzione dell’attività della telomerasi, evidenziando come questo enzima possa regolarne l’espressione attraverso modifiche post-traduzionali di alcuni istoni. La natura di queste modifiche deve ancora essere identificata [Pompella, 2013].
1.6.4 SIRT1 e i fattori di trascrizione
Le sirtuine hanno la capacità di deacetilare, oltre agli istoni, anche fattori di trascrizione con conseguente interferenza sull'espressione genica. Nella maggior parte dei casi, questi fattori controllano geni legati alla crescita, al ciclo cellulare, all'apoptosi e al metabolismo energetico; molti di loro vengono regolati negativamente da SIRT1. Questo comporta un’alterazione degli equilibri metabolici e di sopravvivenza cellulare,
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poiché la deacetilazione di residui lisinici porta ad una diminuzione dell’espressione di fattori trascrizionali, quali p53, FOXO1, PPARγ, HSF1, Ku70, PGC-1α e NF-κB.
SIRT1 e p53: inibizione dell’apoptosi
Il secondo target di SIRT1 descritto nei topi e nell’uomo, è stato il soppressore tumorale p53. C’è una relazione intima tra queste due proteine, che non solo sono fisicamente associate, ma regolano vicendevolmente le rispettive attività.
La proteina p53 è coinvolta nel controllo del ciclo cellulare e possiede nella regione C-terminale vari potenziali siti di acetilazione su residui di lisina, sui quali SIRT1 può esplicare la sua attività catalitica [Luo et al., 2001]. La p53 in forma acetilata attiva il programma trascrizionale con aumento della proliferazione cellulare. Infatti, nelle cellule tumorali e cancerogene questo fattore di trascrizione è iperacetilato. In vitro e
in vivo, in modelli animali, l’over-espressione di SIRT1 rallenta la proliferazione
cellulare mediante la deacetilazione di p53, indicando SIRT1 come un potenziale bersaglio di farmaci antitumorali (Figura 9) [Deng, 2009].
Figura 9. Diminuita espressione di SIRT1 durante l’invecchiamento e relative conseguenze.
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SIRT1 e FOXO1: resistenza allo stress e sopravvivenza cellulare
La famiglia FOXO (Forkhead box type O) è formata da 4 proteine (FOXO1-4) coinvolte in varie funzioni cellulari, quali la risposta allo stress ossidativo, la regolazione del ciclo cellulare e la risposta all’insulina. In seguito ad uno stress cellulare, l’aumento di espressione di SIRT1 provoca la deacetilazione del fattore trascrizionale FOXO, con conseguente incremento dell’espressione di geni coinvolti nella resistenza allo stress, nel rallentamento del ciclo cellulare e nella inibizione dell’apoptosi *Motta et al.,
2004+. L’isoforma FOXO1 è coinvolta nel meccanismo di trasduzione intracellulare
dell’insulina. L’insulina, tramite l’enzima Akt, regola l’espressione di diversi enzimi gluconeogenici e lipogenici mediante il controllo dell’attività di FOXO1 che si trova soprattutto nei tessuti responsivi all’insulina, quali il fegato, il tessuto adiposo e le β-cellule pancreatiche. L’attivazione di FOXO1 mediante acetilazione di residui lisinici, induce la sua traslocazione dal nucleo al citoplasma, inibendo l’attivazione degli enzimi gluconeogenici e favorendo l’attivazione dei geni coinvolti nella glicolisi quali la glucosio-6-fosfatasi [Tadahiro et al., 2002]. In condizioni di digiuno prolungato o di restrizione calorica, l’iper-espressione e l’attivazione di SIRT1 inducono la deacetilazione di FOXO1, che ritorna nel nucleo favorendo la gluconeogenesi e inibendo la glicolisi. Pertanto, è fondamentale il ruolo di SIRT1 nella regolazione del metabolismo energetico cellulare.
SIRT1 e PPARγ: inibizione della lipogenensi e stimolazione della lipolisi
SIRT1 agisce come regolatore negativo nel processo adipogenico. È stato infatti dimostrato che in topi transgenici per SIRT1 il livello intracellulare di trigliceridi era diminuito del 50%, mentre in topi knockout per SIRT1 la quantità di acidi grassi era notevolmente aumentata [Picard et al., 2004]. In condizioni di restrizione calorica, SIRT1 inibisce PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), un fattore trascrizionale essenziale per il differenziamento degli adipociti. Nel tessuto adiposo bianco, in risposta a restrizione calorica, SIRT1 lega PPAR attraverso il cofattore PGC-1α, inibisce l’adipogenesi e stimola la lipolisi, cioè la mobilizzazione degli acidi grassi.
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SIRT1 e Ku70: aumento dell’attività di riparazione del DNA
SIRT1 interagisce direttamente con Ku70, una proteina coinvolta nella riparazione del DNA, con la quale forma un complesso. L’interazione tra SIRT1 e Ku70 porta ad un aumento dell’attività di riparazione del DNA e promuove la sopravvivenza cellulare in risposta allo stress.
SIRT1 e PGC-1α: diminuzione della glicolisi a favore della gluconeogenesi
Il fattore PGC-1αa (PPARγ co-activator 1α) è un coattivatore trascrizionale di recettori nucleari che induce la biogenesi dei mitocondri, promuove il rimodellamento della composizione delle fibre muscolari ed è coinvolto nella regolazione del metabolismo glucidico e lipidico. Grazie alla deacetilazione di PGC-1α, SIRT1 reprime la glicolisi, favorisce la gluconeogenesi e incrementa l’output di glucosio epatico [Lagouge et al.,
2006].
SIRT1 e NF-κB: inibizione dell’apoptosi e regolazione della risposta immunitaria
Il fattore nucleare κB, è un complesso proteico dimerico di trascrizione, che regola l’espressione di geni coinvolti nella risposta immunitaria ed infiammatoria, nella proliferazione e nel differenziamento cellulare. Uno dei principali meccanismi di inattivazione di NF-κB è la deacetilazione che avviene tramite interazioni del fattore stesso con co-repressori, gli enzimi HDACs. Questi traslocano un gruppo acetile dai cinque residui di lisina della proteina ad altri substrati. SIRT1 deacetila selettivamente la componente p65 della proteina sul residuo di Lys=;:, portando alla sua inattivazione. Un recente studio ha dimostrato che oltre a bloccare la proliferazione cellulare, SIRT1 agendo su NF-κB, sensibilizza le cellule all’apoptosi indotta dal TNF-α. Nelle microglia NF-κB è coinvolto nella morte neuronale indotta dal peptide β-amiloide, il quale causa il morbo di Alzheimer. SIRT1 può dunque giocare un ruolo neuroprotettivo inattivando NF-κB *Chen et al., 2005].
1.6.5 Sirtuine, danno tissutale e riparazione
Le sirtuine sono dei modulatori fisiologici fondamentali che controllano un elevato numero di pathways metabolici e funzioni cruciali, inclusi la riparazione e la morte
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cellulare. Questi meccanismi si verificano in virtù delle loro dirette azioni enzimatiche su target proteici nonché a causa delle alterazioni nei livelli di metaboliti correlati alla reazione. Sebbene non tutte le sirtuine siano prettamente deacetilasi, il complesso proteico che include PGC-1α, SIRT1 e AMPK è considerato parte critica nella regolazione metabolica cellulare [Canto e Auwerx, 2009]. SIRT1 e AMPK agiscono come sensori metabolici grazie alla loro abilità nel deacetilare e nel fosforilare, rispettivamente, il fattore di biogenesi mitocondriale PGC-1α. Perciò le azioni di SIRT1 sono strettamente correlate all’aumento delle funzioni mitocondriali, sono coinvolte nella biogenesi e nell’attenuazione del danno redox, facendo di questa proteina un attraente target terapeutico [Canto e Auwerx, 2012]. Ciò è stato ulteriormente confermato dall’osservazione che a seguito di stress cellulare, l’attività di SIRT1 è alterata e la modulazione della sua attività ed espressione a seguito di danno cellulare sono importanti nel ristabilire l’omeostasi, la riparazione e la morte cellulare.
1.6.6 SIRT1 e le patologie metaboliche
Una prima indicazione che SIRT1 potesse essere rilevante nelle patologie legate al metabolismo, si ebbe con la scoperta che questa proteina poteva influenzare la differenziazione e l’accumulo dei grassi nelle linee di cellule adipose 3T3-L1 e nei pre-adipociti primari dei ratti [Picard et al., 2004]. In seconda battuta, la restrizione calorica innescava un incremento SIRT1-dipendente di PGC-1α, coinvolto nella biogenesi mitocondriale a livello muscolare [Nisoli et al., 2005+, e attivava l’ossidazione degli acidi grassi (mediata da SIRT1) e il recettore della proliferazione perossisomale α (PPAR-α) *Purushotham et al., 2009], la cui azione combinata favorisce la sensibilità all’insulina ed un evidente minor declino aging-related.
Nel fegato, si è visto che SIRT1 controlla due pathways con effetti opposti sul meccanismo della gluconeogenesi. Da una parte, l’attivazione di PGC-1α e FOXO1 sembra favorire la produzione di glucosio [Rodgers et al., 2005+, mentre dall’altra la deacetilazione e la destabilizzazione del coattivatore CRCT2 della proteina di legame in risposta all’AMP ciclico (CREB) dovrebbe inibirla *Liu et al., 2008]. Nello steady-state della restrizione calorica, l‘effetto netto di questi due meccanismi è un leggero aumento della produzione di glucosio. È stato dimostrato che la somministrazione
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orale di potenziali composti attivanti SIRT1 mitiga gli effetti pro-diabetici di una dieta ad alto contenuto di grassi senza importanti effetti tossici, risultato che suggerisce che l’attivazione di questo enzima possa avere azione anti-diabetica non farmacologicamente dannosa. Questa ipotesi fu confermata attraverso l’impiego del polifenolo naturale resveratrolo [Baur et al., 2006; Lagouge et al., 2006] ed in seguito dall’utilizzo di composti sintetici attivanti più selettivi *Milne et al., 2006]. In quest’ultimo caso, l’efficacia dei composti fu testata anche su modelli genetici di obesità murini (leptin-deficient ob/ob mouse) e in ratti obesi. Benchè questi risultati fossero coerenti con gli effetti noti di SIRT1 su muscoli, fegato e adipociti, studi recenti hanno evidenziato che questa sirtuina esercita la sua azione anche sull’ipotalamo regolando il senso della fame (appetito) ed il consumo energetico [Ramadori et al.,
2010; Satoh et al., 2010].
In ogni caso, è chiaro che in diversi modelli genetici murini di over-espressione di SIRT1 si ha una prevenzione dal diabete. In altri due modelli, emergeva una protezione contro il declino metabolico indotto da una dieta ad alto contenuto in grassi o, più sorprendentemente dal normale invecchiamento [Banks et al., 2008; Pfluger et al.,
2008+. In più, l’attivazione di SIRT1, sia chimica che genetica, è associata con
cambiamenti nei meccanismi di trascrizione del genoma, normalmente indotti dalla restrizione calorica [Barger et al., 2008; Smith et al., 2009]. Messi insieme, questi studi genetici forniscono forti evidenze che SIRT1 gioca un ruolo centrale nel guidare il fenotipo dei roditori verso il “fitness metabolico”. Pertanto, fra queste possibilità sembra più realistico che i composti attivanti SIRT1 operino l’attivazione in vivo (sia direttamente che indirettamente), e questa che possa proteggere anche da altre patologie connesse all’invecchiamento [Herranz et al., 2010+. L’effetto anti-infiammatorio delle sirtuine può essere molto più ampio poiché sia SIRT1 sia SIRT6 reprimono l’attività del principale fattore di trascrizione pro-infiammatorio, il fattore nucleare κB *Yeung et al., 2004; Kawahara et al., 2009]. In altri studi su modelli murini, è emerso che SIRT1 protegge dal cancro al colon e al seno [Firestein et al., 2008; Wang
et al., 2008+ e il fatto che reprima anche il fattore inducibile l’ipossia 1α, promuove la
sua candidatura a soppressore tumorale. In ogni caso la relazione tra SIRT1 e cancro non è ancora del tutto chiara, dal momento che altri studi attestano che le sirtuine
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hanno anche proprietà oncogene in determinati scenari tumorali; nella terapia del cancro recentemente è emersa l’importanza di SIRT3 come altro potenziale target) [Lee et al., 2011; Chen et al., 2005].
1.6.7 SIRT1 e le patologie cardiovascolari
Molti studi hanno mostrato l’importanza delle sirtuine nel migliorare la funzionalità e la sopravvivenza degli organi a seguito di un danno ai tessuti [Sundarsen et al., 2009]. In pazienti post-infarto al miocardio (MI), il danno da ischemia/riperfusione (I/R) rappresenta la causa principale del rimodellamento e dello scompenso cardiaco [Yang
et al., 2010]. Detto questo, interventi per prevenire il danno da I/R diventano potenti
mezzi per ridurre la mortalità in pazienti post MI. Da studi condotti sulle sirtuine è emerso che SIRT1, in particolare, può essere efficientemente implicato nella gestione e nella prevenzione da questo tipo di lesione (Figura 9) [Hsu et al., 2010; Nadtochiy et
al., 2011; Della-Morte et al., 2009].
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Il danno da I/R è associato ad una riduzione dell’mRNA e delle proteine correlate a SIRT1. Usando topi transgenici con una specifica over-espressione cardiaca di SIRT1, Hsu e colleghi dimostrarono una significante riduzione delle aree miocardiche infartuate e un miglior recupero in seguito a riperfusione in cuori isolati, confrontati con il wild type. Al contrario, un knockdown cardiaco specifico di SIRT1, determina un aumento delle dimensioni delle aree colpite. Gli effetti osservati della over-espressione di SIRT1 sono attribuiti ad una soppressione dello stress ossidativo e dell’apoptosi, mediata dalla up regulation di molecole antiossidanti come la manganese-superossido-dismutasi e la down regulation di molecole pro-apoptotiche, innescata da FOXO1 [Hsu
et al., 2010+. Uno dei cambiamenti prominenti che si verificano durante l’ipertrofia
cardiaca, è il passaggio dell’isoforma α- a β della catena pesante della miosina (MHC) [Mercardier et al., 1981]. È interessante notare che l’assunzione di fruttosio ha mostrato avere effetto protettivo sul cuore a seguito di danno da I/R, grazie all’induzione dell’espressione dell’α-MHC. Inoltre, stimola i livelli di NAD⁺ e SIRT1 nel cuore, effetti ottenuti anche grazie alla somministrazione dell’agonista naturale resveratrolo [Pillai et al., 2008+. Il ruolo di SIRT1 nell’espressione di α-MHC è stato successivamente confermato da studi effettuati sull’over-espressione, specificatamente cardiaca, dell’enzima. Interessante da notare è che sia il diretto agonista di SIRT1 (resveratrolo) che la sua indiretta attivazione NAD⁺-dipendente, causano effetti fisiologici simili in modelli animali. Nonostante ciò, il meccanismo attraverso cui SIRT1 induce α-MHC è ancora oggetto di controversie.
Figura 11. Precondizionamento ischemico.
Il precondizionamento ischemico (IPC) è efficace nel limitare il danno a livello cardiaco che si ha durante prolungata occlusione e riperfusione (Figura 11) [Yang et al., 2010]. Nadtochiy ed il suo team, studiarono il ruolo di SIRT1 e gli effetti cardioprotettivi
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dell’IPC acuto, usando topi aventi da un lato l’enzima over-espresso e dall’altro una sua deficienza. Coerentemente col ruolo di SIRT1, IPC induce deacetilazione dei residui di lisina a livello citosolico in cuori wild type, mentre i cuori SIRT1-deficient mostravano alta acetilazione di questi aminoacidi ed erano refrattari al precondizionamento. La diminuita acetilazione nei topi over-esprimenti SIRT1 era accompagnata da protezione endogena dal danno da I/R. Sia IPC indotto da deacetilazione delle lisine che la protezione cardiaca sono inibite dall’inibitore di SIRT1, splitomicina *Nadtochiy et al.,
2011].
Nampt, enzima chiave nella sintesi del NAD⁺, è un regolatore cruciale dello status energetico e della sopravvivenza del cardiomiocita [Hsu et al., 2009]. Fu visto che Nampt era coinvolto nella mediazione degli effetti cardioprotettivi di IPC contro l’ischemia e la riperfusione, azione simulata anche dalla nicotinammide-mononucleotide (NMN) esogena, un prodotto di Nampt nel pathway di recupero di NAD⁺. Dall’altro lato, Nampt può esser secreto dai cardiomiociti con funzione di citochina pro-infiammaoria. È stato scoperto che il Nampt esogeno è un regolatore positivo dell’ipertrofia cardiaca e di un eventuale rimodellamento cardiaco avverso [Pillai et al., 2013].
È interessante notare che la cardioprotezione conferita da IPC peggiora con l’avanzare dell’età *Adam et al., 2013+. La mancata tolleranza verso l’ischemia in cuori anziani è stata imputata ad una riduzione nell’espressione e nell’attività di SIRT1, sebbene uno studio ne abbia escluso il coinvolgimento.
Come precedentemente detto, la restrizione calorica incrementa la longevità nel lievito e in altre specie [Rogina et al., 2002; Lakowski e Hekimi, 1998; Lin et al., 2011]. Shinumura e colleghi studiarono gli effetti di CR a breve e a lungo termine sulla tolleranza ischemica e il precondizionamento ischemico (IPC) in ratti anziani [Shinmura
et al., 2005; Shinmura et al., 2008]. Short-term CR migliorava la funzionalità del
ventricolo sinistro sia in ratti giovani che anziani, e questo era associato ad un aumento della fosforilazione di AMPK. Anche in condizioni di long-term CR vi era un maggior recupero dell’attività ventricolare sinistra ed una riduzione dell’area infartuata dopo l’ischemia-riperfusione. Questi cambiamenti non comportavano, però, nessuna modificazione nell’espressione miocardica di AMPK totale o fosforilato.
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Sorprendentemente la cardioprotezione indotta da long-term CR era associata ad un aumento del contenuto di SIRT1 nucleare ossido nitrico-dipendente [Shinmura et l.,
2005]. La protezione dal danno da I/R mediata da CR era accompagnata da up regulation di Nampt mentre l’effetto protettivo veniva meno in topi SIRT1-/-,
suggerendo l’ipotesi di un asse Nampt/SIRT1 *Yamamoto et al., 2014]. Analisi sui cambiamenti molecolari nella cardioprotezione da CR rivelano una complessiva riduzione delle proteine mitocondriali acetilate. Coerentemente con un ruolo per le sirtuine, la deacetilazione di specifiche proteine della catena di trasporto degli elettroni preservava l’integrità mitocondriale impedendo l’accumulo tossico di ROS [Shinmura et al., 2011]. La decatilazione di queste proteine implica anche un coinvolgimento delle sirtuine mitocondriali oltre quelle nucleari e/o citoplasmatiche, come SIRT1 (Figura 12).
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SIRT1 esercita i suoi effetti sia a livello della trascrizione che in fase post-traduzionale. Nel primo caso, influenza l’espressione di diversi geni antiossidanti e di molecole apoptotiche, attraverso la stimolazione dell’attività di FOXO1 *Hsu et al., 2010]. Da uno studio condotto da Rui-Hong Wang e team è emerso che la deficienza di SIRT1 a livello epatico nei topi potesse danneggiare la via mTorc2/AKT, conducendo a danni ossidativi e insulino-resistenza [Wang et al., 2011]. In fase post-traduzionale, SIRT1 influenza l’acetilazione e l’attività di un alto numero di proteine. Allo stesso tempo anche la regolazione di questa sirtuina si ha a vari livelli. Una modificazione carbonilica durante l’invecchiamento ne indebolisce l’azione e causa intolleranza ischemica al miocardio, eventi che possono essere ristabiliti dall’attivazione dell’aldeide-deidrogenasi cardiaca [Gu et al., 2013]. Per chiarire meglio questi fenomeni sono necessari molti altri studi per indirizzare i cambiamenti post-traduzionali in SIRT1 e nelle altre sirtuine che potrebbero influenzare anche la loro compartimentalizzazione e funzione all’interno della cellula. Nei cardiomiociti l’espressione di SIRT1 è regolata dal microRNA, miR199a, anch’esso sottoposto a down regulation durante l’ischemia, che favorisce il rapido accumulo di HIF-1α, impedendone la degradazione *Rane et al., 2009].
SIRT1 protegge anche le cellule della muscolatura liscia inibendo l’espressione del recettore per l’angiotensina AT1 *Li et al., 2011; Miyazaki et al., 2008]. Topi AT1 -/- producono più bassi quantitativi di specie reattive dell’ossigeno e vivono più a lungo dei topi normali [Benigni et al., 2009]. Successivamente è stato dimostrato che la riduzione di ROS in questo tipo di roditori era principalmente mediata dall’azione di un’altra isoforma, la SIRT3.
La prima connessione tra SIRT1 e le cellule endoteliali è avvenuta grazie alla scoperta che l’enzima deacetila e attiva la ossido-nitrico-sintetasi endoteliale (eNOS) [Nisoli et
al., 2005+. L’attivazione di eNOS e la repressione di AT1 suggeriscono che SIRT1 possa
contrastare un’elevata pressione sanguigna. SIRT1, inoltre, inibisce la senescenza delle cellule endoteliali e il suo effetto salutare su queste cellule potrebbe mitigare il fenomeno dell’aterosclerosi *Ota et al., 2008]. Interessante risulta il fatto che CR possa proteggere dall’ateriosclerosi e molti dei suoi effetti fisiologici sono attenuati in topi eNOS -/-. Questi risultati suggeriscono che SIRT1 aiuta nel favorire i benefici di CR sulla
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funzione cardiovascolare attraverso i suoi effetti su eNOS, AT1 e probabilmente su altri target ancora.
SIRT1 e l’angiogenesi
Un cuore adulto è pienamente capace di andare incontro ad ipertrofia in risposta ad un aumento del carico di lavoro. Questa è una risposta adattativa nelle fasi iniziali dello stress cellulare; offre un meccanismo short-term per ridurre l’affaticamento a livello della parete ventricolare e migliorare la funzione cardiaca. Prolungando la durata dello stress, si assiste ad un’inversione del processo che diventa negativo, arrivando ad ottenere morte dei miociti, fibrosi, dilatazione ventricolare e il passaggio ad un’ipertrofia infausta, precedente all’insufficienza cardiaca. È stato dimostrato che il venir meno del coordinamento tra crescita del muscolo cardiaco e angiogenesi coronaria provoca stress ossidativo, che contribuisce al passaggio dalla ipertrofia cardiaca adattativa alla ipertrofia patologica ed infine all’insufficienza cardiaca [Shiojima et al., 2005].
SIRT1 è stato identificato come un regolatore critico nel determinare l’insorgenza dell’angiogenesi durante la crescita vascolare *Potente et al., 2007] ed una riduzione della sua espressione (knockdown) causa una quasi totale perdita di questa attivazione
in vitro. Inoltre a livello endoteliale, topi knockout per SIRT1, mostrano una capacità
ridotta di formare nuovi vasi sanguigni nei tessuti ischemici, suggerendo che un aumento nell’attivazione di SIRT1 è necessario per promuovere l’angiogenesi compensatoria, mentre una sua riduzione causa incremento del danno ossidativo al miocardio. Similmente, un pre-trattamento con resveratrolo induce angiogenesi nei modelli di infarto miocardico nei ratti [Fukuda et al., 2006]. Alcuni altri studi dimostrano che il resveratrolo, contrariamente a quanto finora detto, sopprime l’angiogenesi nei modelli tumorali e previene così la loro crescita, andando a confermare in parte il suo ruolo di potenziale agente anti-proliferativo [Kraft et al.,
2009].
Oltre al ruolo di SIRT1 nel regolare l’angiogenesi, la sua attività è importante anche nel mantenere l’omeostasi delle cellule endoteliali. L’endotelio ricopre la superficie interna del sistema vascolare ed un suo malfunzionamento è accompagnato da un
