SIRT1 e le patologie cardiovascolari

Molti studi hanno mostrato l’importanza delle sirtuine nel migliorare la funzionalità e la sopravvivenza degli organi a seguito di un danno ai tessuti [Sundarsen et al., 2009]. In pazienti post-infarto al miocardio (MI), il danno da ischemia/riperfusione (I/R) rappresenta la causa principale del rimodellamento e dello scompenso cardiaco [Yang

et al., 2010]. Detto questo, interventi per prevenire il danno da I/R diventano potenti

mezzi per ridurre la mortalità in pazienti post MI. Da studi condotti sulle sirtuine è emerso che SIRT1, in particolare, può essere efficientemente implicato nella gestione e nella prevenzione da questo tipo di lesione (Figura 9) [Hsu et al., 2010; Nadtochiy et

al., 2011; Della-Morte et al., 2009].

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Il danno da I/R è associato ad una riduzione dell’mRNA e delle proteine correlate a SIRT1. Usando topi transgenici con una specifica over-espressione cardiaca di SIRT1, Hsu e colleghi dimostrarono una significante riduzione delle aree miocardiche infartuate e un miglior recupero in seguito a riperfusione in cuori isolati, confrontati con il wild type. Al contrario, un knockdown cardiaco specifico di SIRT1, determina un aumento delle dimensioni delle aree colpite. Gli effetti osservati della over-espressione di SIRT1 sono attribuiti ad una soppressione dello stress ossidativo e dell’apoptosi, mediata dalla up regulation di molecole antiossidanti come la manganese-superossido- dismutasi e la down regulation di molecole pro-apoptotiche, innescata da FOXO1 [Hsu

et al., 2010+. Uno dei cambiamenti prominenti che si verificano durante l’ipertrofia

cardiaca, è il passaggio dell’isoforma α- a β della catena pesante della miosina (MHC) [Mercardier et al., 1981]. È interessante notare che l’assunzione di fruttosio ha mostrato avere effetto protettivo sul cuore a seguito di danno da I/R, grazie all’induzione dell’espressione dell’α-MHC. Inoltre, stimola i livelli di NAD⁺ e SIRT1 nel cuore, effetti ottenuti anche grazie alla somministrazione dell’agonista naturale resveratrolo [Pillai et al., 2008+. Il ruolo di SIRT1 nell’espressione di α-MHC è stato successivamente confermato da studi effettuati sull’over-espressione, specificatamente cardiaca, dell’enzima. Interessante da notare è che sia il diretto agonista di SIRT1 (resveratrolo) che la sua indiretta attivazione NAD⁺-dipendente, causano effetti fisiologici simili in modelli animali. Nonostante ciò, il meccanismo attraverso cui SIRT1 induce α-MHC è ancora oggetto di controversie.

Figura 11. Precondizionamento ischemico.

Il precondizionamento ischemico (IPC) è efficace nel limitare il danno a livello cardiaco che si ha durante prolungata occlusione e riperfusione (Figura 11) [Yang et al., 2010]. Nadtochiy ed il suo team, studiarono il ruolo di SIRT1 e gli effetti cardioprotettivi

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dell’IPC acuto, usando topi aventi da un lato l’enzima over-espresso e dall’altro una sua deficienza. Coerentemente col ruolo di SIRT1, IPC induce deacetilazione dei residui di lisina a livello citosolico in cuori wild type, mentre i cuori SIRT1-deficient mostravano alta acetilazione di questi aminoacidi ed erano refrattari al precondizionamento. La diminuita acetilazione nei topi over-esprimenti SIRT1 era accompagnata da protezione endogena dal danno da I/R. Sia IPC indotto da deacetilazione delle lisine che la protezione cardiaca sono inibite dall’inibitore di SIRT1, splitomicina *Nadtochiy et al.,

2011].

Nampt, enzima chiave nella sintesi del NAD⁺, è un regolatore cruciale dello status energetico e della sopravvivenza del cardiomiocita [Hsu et al., 2009]. Fu visto che Nampt era coinvolto nella mediazione degli effetti cardioprotettivi di IPC contro l’ischemia e la riperfusione, azione simulata anche dalla nicotinammide- mononucleotide (NMN) esogena, un prodotto di Nampt nel pathway di recupero di NAD⁺. Dall’altro lato, Nampt può esser secreto dai cardiomiociti con funzione di citochina pro-infiammaoria. È stato scoperto che il Nampt esogeno è un regolatore positivo dell’ipertrofia cardiaca e di un eventuale rimodellamento cardiaco avverso [Pillai et al., 2013].

È interessante notare che la cardioprotezione conferita da IPC peggiora con l’avanzare dell’età *Adam et al., 2013+. La mancata tolleranza verso l’ischemia in cuori anziani è stata imputata ad una riduzione nell’espressione e nell’attività di SIRT1, sebbene uno studio ne abbia escluso il coinvolgimento.

Come precedentemente detto, la restrizione calorica incrementa la longevità nel lievito e in altre specie [Rogina et al., 2002; Lakowski e Hekimi, 1998; Lin et al., 2011]. Shinumura e colleghi studiarono gli effetti di CR a breve e a lungo termine sulla tolleranza ischemica e il precondizionamento ischemico (IPC) in ratti anziani [Shinmura

et al., 2005; Shinmura et al., 2008]. Short-term CR migliorava la funzionalità del

ventricolo sinistro sia in ratti giovani che anziani, e questo era associato ad un aumento della fosforilazione di AMPK. Anche in condizioni di long-term CR vi era un maggior recupero dell’attività ventricolare sinistra ed una riduzione dell’area infartuata dopo l’ischemia-riperfusione. Questi cambiamenti non comportavano, però, nessuna modificazione nell’espressione miocardica di AMPK totale o fosforilato.

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Sorprendentemente la cardioprotezione indotta da long-term CR era associata ad un aumento del contenuto di SIRT1 nucleare ossido nitrico-dipendente [Shinmura et l.,

2005]. La protezione dal danno da I/R mediata da CR era accompagnata da up regulation di Nampt mentre l’effetto protettivo veniva meno in topi SIRT1-/-,

suggerendo l’ipotesi di un asse Nampt/SIRT1 *Yamamoto et al., 2014]. Analisi sui cambiamenti molecolari nella cardioprotezione da CR rivelano una complessiva riduzione delle proteine mitocondriali acetilate. Coerentemente con un ruolo per le sirtuine, la deacetilazione di specifiche proteine della catena di trasporto degli elettroni preservava l’integrità mitocondriale impedendo l’accumulo tossico di ROS [Shinmura et al., 2011]. La decatilazione di queste proteine implica anche un coinvolgimento delle sirtuine mitocondriali oltre quelle nucleari e/o citoplasmatiche, come SIRT1 (Figura 12).

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SIRT1 esercita i suoi effetti sia a livello della trascrizione che in fase post-traduzionale. Nel primo caso, influenza l’espressione di diversi geni antiossidanti e di molecole apoptotiche, attraverso la stimolazione dell’attività di FOXO1 *Hsu et al., 2010]. Da uno studio condotto da Rui-Hong Wang e team è emerso che la deficienza di SIRT1 a livello epatico nei topi potesse danneggiare la via mTorc2/AKT, conducendo a danni ossidativi e insulino-resistenza [Wang et al., 2011]. In fase post-traduzionale, SIRT1 influenza l’acetilazione e l’attività di un alto numero di proteine. Allo stesso tempo anche la regolazione di questa sirtuina si ha a vari livelli. Una modificazione carbonilica durante l’invecchiamento ne indebolisce l’azione e causa intolleranza ischemica al miocardio, eventi che possono essere ristabiliti dall’attivazione dell’aldeide-deidrogenasi cardiaca [Gu et al., 2013]. Per chiarire meglio questi fenomeni sono necessari molti altri studi per indirizzare i cambiamenti post-traduzionali in SIRT1 e nelle altre sirtuine che potrebbero influenzare anche la loro compartimentalizzazione e funzione all’interno della cellula. Nei cardiomiociti l’espressione di SIRT1 è regolata dal microRNA, miR199a, anch’esso sottoposto a down regulation durante l’ischemia, che favorisce il rapido accumulo di HIF-1α, impedendone la degradazione *Rane et al., 2009].

SIRT1 protegge anche le cellule della muscolatura liscia inibendo l’espressione del recettore per l’angiotensina AT1 *Li et al., 2011; Miyazaki et al., 2008]. Topi AT1 -/- producono più bassi quantitativi di specie reattive dell’ossigeno e vivono più a lungo dei topi normali [Benigni et al., 2009]. Successivamente è stato dimostrato che la riduzione di ROS in questo tipo di roditori era principalmente mediata dall’azione di un’altra isoforma, la SIRT3.

La prima connessione tra SIRT1 e le cellule endoteliali è avvenuta grazie alla scoperta che l’enzima deacetila e attiva la ossido-nitrico-sintetasi endoteliale (eNOS) [Nisoli et

al., 2005+. L’attivazione di eNOS e la repressione di AT1 suggeriscono che SIRT1 possa

contrastare un’elevata pressione sanguigna. SIRT1, inoltre, inibisce la senescenza delle cellule endoteliali e il suo effetto salutare su queste cellule potrebbe mitigare il fenomeno dell’aterosclerosi *Ota et al., 2008]. Interessante risulta il fatto che CR possa proteggere dall’ateriosclerosi e molti dei suoi effetti fisiologici sono attenuati in topi eNOS -/-. Questi risultati suggeriscono che SIRT1 aiuta nel favorire i benefici di CR sulla

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funzione cardiovascolare attraverso i suoi effetti su eNOS, AT1 e probabilmente su altri target ancora.

SIRT1 e l’angiogenesi

Un cuore adulto è pienamente capace di andare incontro ad ipertrofia in risposta ad un aumento del carico di lavoro. Questa è una risposta adattativa nelle fasi iniziali dello stress cellulare; offre un meccanismo short-term per ridurre l’affaticamento a livello della parete ventricolare e migliorare la funzione cardiaca. Prolungando la durata dello stress, si assiste ad un’inversione del processo che diventa negativo, arrivando ad ottenere morte dei miociti, fibrosi, dilatazione ventricolare e il passaggio ad un’ipertrofia infausta, precedente all’insufficienza cardiaca. È stato dimostrato che il venir meno del coordinamento tra crescita del muscolo cardiaco e angiogenesi coronaria provoca stress ossidativo, che contribuisce al passaggio dalla ipertrofia cardiaca adattativa alla ipertrofia patologica ed infine all’insufficienza cardiaca [Shiojima et al., 2005].

SIRT1 è stato identificato come un regolatore critico nel determinare l’insorgenza dell’angiogenesi durante la crescita vascolare *Potente et al., 2007] ed una riduzione della sua espressione (knockdown) causa una quasi totale perdita di questa attivazione

in vitro. Inoltre a livello endoteliale, topi knockout per SIRT1, mostrano una capacità

ridotta di formare nuovi vasi sanguigni nei tessuti ischemici, suggerendo che un aumento nell’attivazione di SIRT1 è necessario per promuovere l’angiogenesi compensatoria, mentre una sua riduzione causa incremento del danno ossidativo al miocardio. Similmente, un pre-trattamento con resveratrolo induce angiogenesi nei modelli di infarto miocardico nei ratti [Fukuda et al., 2006]. Alcuni altri studi dimostrano che il resveratrolo, contrariamente a quanto finora detto, sopprime l’angiogenesi nei modelli tumorali e previene così la loro crescita, andando a confermare in parte il suo ruolo di potenziale agente anti-proliferativo [Kraft et al.,

2009].

Oltre al ruolo di SIRT1 nel regolare l’angiogenesi, la sua attività è importante anche nel mantenere l’omeostasi delle cellule endoteliali. L’endotelio ricopre la superficie interna del sistema vascolare ed un suo malfunzionamento è accompagnato da un

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aumento nella permeabilità cellulare, apoptosi ed infiammazione conducendo infine alla formazione di placche [Goligorsky, 2005+. L’ossido nitrico sintetizzato dalle cellule endoteliali promuove la vasodilatazione ed esplica effetti ateroprotettivi. Questo gas endogeno è prodotto dall’ossidonitrico-sintetasi endoteliale (eNOS), target di SIRT1, che lo deacetila, stimolando in tal modo la sua attività e aumentandone la sintesi, laddove una inibizione dell’enzima bloccherebbe la vasodilatazione endotelio- dipendente e la produzione di NO [Mattagajasingh et al., 2007]. Conseguentemente, l’attivazione di SIRT1 è associata ad un decremento dell’aterosclerosi *Zhang et al.,

2008]. In più, altri studi hanno evidenziato che il resveratrolo attiva eNOS e quindi la

produzione di NO, conferendo protezione al cuore dal danno da ischemia-riperfusione [Hung et al., 2004].

Concludendo, attraverso la regolazione della crescita dei cardiomiociti, l’attivazione di SIRT1 possiede anche un potenziale nel coordinare l’induzione dell’angiogenesi coronaria.

SIRT1 e l’autofagia

L’autofagia è un importante meccanismo per la degradazione di masse cellulari, che si verifica con tre possibili processi: la microautofagia, l’autofagia chaperone-mediata (CMA) e la macroautofagia (Figura 13). Quest’ultima prevede la formazione di un autofagosoma, una vescicola delimitata da un doppia membrana, che si fonde ai lisosomi per la degradazione degli scarti cellulari inglobati; è la più studiata e spesso ci si riferisce a questo meccanismo semplicemente come “autofagia” *Mizushima et al,

2010].

L’autofagia è tipicamente attivata in uno stato di carenza di nutrienti ed energetica, in cui l’attivazione del meccanismo self-eating ricicla aminoacidi e acidi grassi recuperati in seguito dai lisosomi col fine di produrre ATP, necessario per la sopravvivenza cellulare. L’autofagia controlla positivamente la qualità cellulare eliminando proteine mal-ripiegate o modificate sfavorevolmente ed organelli disfunzionanti.

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Figura 13. Fasi del processo catabolico dell’autofagia.

La carenza di nutrienti induce l’attivazione di SIRT1 che a sua volta stimola l’autofagia nei cardiomiociti. Deacetila il fattore FOXO1, upregolando in tal modo le proteine richieste per l’autofagia, come la proteina Rab 7 (Rab7), che stimola la fusione lisosoma-autofagosoma [Hariharan et al., 2010] e alcune proteine Atg [Lee et al.,

2008], nonché attraverso la stimolazione di AMPK [Fulco et al., 2008; Matsui et al., 2007+. L’espressione proteica di Nampt è ridotta durante l’ischemia ed una sua

implementazione migliora l’induzione dell’autofagia, riducendo il danno miocardico [Hsu et al., 2009]. Questi risultati suggeriscono che il pathway Nampt-SIRT1 stimola l’autofagia durante l’ischemia miocardica, e protegge così il cuore dalla morte cellulare. Da notare, comunque, che un’eccessiva attivazione dell’autofagia durante la fase di riperfusione può esacerbare il danno miocardico.

Così, se la stimolazione dell’autofagia contribuisce al complessivo meccanismo di protezione di SIRT1 durante I/R possiamo determinarlo dalla lunghezza dell’ischemia miocardica prima della riperfusione.