I risultati di tutti gli esperti sono espressi come media +/- SD. Per tutte le analisi statistiche , è stato utilizzato un test a due code dispari Mann-whitney. Un valore p minore 0.05 è considerato rilevante.
RISULTATI.
Sema 4 A è espresso nei macrofagi umani attivati. Sema 4 A stimola l’ attivazione delle cellule T (19) , ma il suo ruolo nel sistema immunitario innato , e soprattutto in relazione all’ attivazione dei macrofagi , è ancora sconosciuto.
Quindi , la prima espressione analizzata di Sema 4 A nei macrofagi umani è stata ottenuta mediante una differenziazione in vitro dei PBMC. Un notevole quantitativo di Sema 4 A trascritto era presente nei macrofagi non stimolato e aumentato in maniera significante da LPS , ma non da IL-4 (non mostrato dai dati).
IFN- gamma da solo non modula il profilo di espressione genetica e decresce leggermente per opera di LPS. LPS , ma non IFN-gamma o IFN –gamma plus LPS , ha aumentato in maniera significativa i livelli di espressione di plexina D1 e plexina B2 , anche se plexina B1 era lievemente espressa sia nelle cellule a riposo che in quelle attivate.
LPS attiva la risposta cellulare , principalmente mediante l’ attivazione di TLR4 , un membro della famiglia TLR (33) , il quale riconosce i pattern molecolari
patogeni specifici giocando così un ruolo cruciale sull’ immunità adattiva e innata (34).
Dunque , abbiamo indagato sull’ espressione di Sema 4 A e i suoi recettori dopo l’ attivazione dei macrofagi di altri agonisti TLR ( PAM3 Cys , TLR1-TLR2 agonista , poly I:C , TLR3 agonista flagellina, R848 ,TLR 7/8 agonista , e CpG ODN 2006,
04
TLR 9 agonista). I livelli trascritti di Sema 4 A erano fortemente aumentati in seguito ad un’ esposizione a lungo termine a LPS , Poly I:C e a maniera ridotta a CpG ODN 2006 , anche se non è stata riscontrata alcuna modulazione significante per TRL agonista flagellina , R848 e PAM3 Cys ( i dati non lo mostrano).
È interessante come poly I:C e il trattamento LPS risultano anche nell’ up
regulation delle trascrizioni di plexina D1 e plexina B2 , anche se gli altri agonisti TLR non modulano la loro espressione. Plexina B1 non era regolata in maniera significativa da qualcuno degli agonisti TLR.
Messi insieme, questi dati indicano che l’ espressione di Sema 4 A è indotta durante l’ attivazione selettiva dei macrofagi , e infatti , può giocare un ruolo importante nella regolazione delle loro proprietà infiammatorie.
SEMA 4 A STIMOLA L’ ATTIVITÀ CHEMIOTATTICA DEI MACROFAGI
ATTRAVERSO PLEXINA D1.
Per comprendere meglio il ruolo di Sema 4 A nei macrofagi umani , abbiamo valutato la sua attività stimolando la loro migrazione.
In un test svolto nella camera chemiotattica di Boyden , Sema 4 A ricombinante umano ha indotto una risposta chemiotattica dose-dipendente a campana.
È evidente che l’ aumento della migrazione dei macrofagi indotta da Sema 4 A era comparabile a quella mediata da MCP-1 .
Per identificare che recettore plexina fosse coinvolto nell’ attività chemiotattica Sema 4 A- dipendente , i macrofagi sono stati incubati con il blocco di Abs per la plexina D1 o B2 prima di testare la loro migrazione chemiotattica. Anche se la plexina B2 Ab era incapace di bloccare la migrazione del Sema 4 A indotto , la neutralizzazione della plexina D1 ha fortemente inibito l’ effetto.
È molto interessante notare inoltre che l’ inibizione di plexina D1 fa diminuire la migrazione basale , indicando un possibile coinvolgimento di Sema 4 A endogeno nella motilità basale. Dato che plexina D1 lega anche Sema3E , noi abbiamo indagato se questa molecola fosse coinvolta nella regolazione della motilità dei macroagi.
Mediante un test in cui aveva luogo la migrazione , abbiamo osservato che Sema 3E esogeno , a differenza di Sema 4 A , non aumenta la migrazione basale dei
56
macrofagi. Anche se la neutralizzazione di plexina D1 ha inibito alquanto la migrazione basale dei macrofagi , Sema 3E esogeno ha contrastato l’ effetto inibitore sulla motilità della cellula da plexina D1-bloccante Ab.
Da notare che la neutralizzazione di plexina D1 nei macrofagi innescata da Sema 4 A associata a Sema 3E non è stata decisiva nella riduzione della migrazione dei macrofagi sotto i livelli basali , come osservato in presenza di Sema 4 A e plexina D1-bloccante Ab .
In base a questi risultati , possiamo ipotizzare che questo effetto potrebbe essere provocato da una competizione tra Sema 3E e Sema 4 A per il recettore plexina D1. Dalle analisi western- blot , abbiamo notato che l’ espressione di Sema 4 A e non di Sema3 E è aumentata nelle cellule attivate comparate con il controllo dei macrofagi. Abbiamo individuato inoltre una notevole quantità di entrambe le cellule associate e di formule rilasciate di Sema 4 A nei macrofagi , come avvenuto con ELISA.
La quantità di proteine Sema 4 A cresce notevolmente nei supernatanti e nei lisati dei macrofagi attivati , evidenziando ch e Sema 4 A agisce come un fattore
solubile che regola le funzioni dei macrofagi in maniera paracrina e autocrina.
SEMA 4 A è UP-REGULATED NELLE INFIAMMAZIONI PERITONEALI.
In seguito , abbiamo esteso le osservazioni in vitro riportate sopra a un modello murino di peritonite indotta da tioglicollato e abbiamo osservato l’ espressione di Sema 4 A nelle cellule peritoneali coinvolte.
Le cellule CD11c e , CD4 , CD8 , e LY6G non hanno espresso Sema 4 A nè nei controlli né negli animali trattati con tioglicollato.
In contrapposizione a ciò , anche se le cellule CD11b + e CD68+ isolati dagli animali controllati non tioglicollato ha indotto una drammatica up-regulation della proteina in queste cellule. È interessante notare come dopo 24 ore , Sema 4 A è principalmente espresso dalle cellule CD11b+ con pochi macrofagi positivi CD68+ e principalmente espresso dalle cellule CD11b+ con pochi macrofagi positivi CD68+ .
48 ore dopo il trattamento , la maggior parte delle cellule CD11 erano negative , anche se Sema 4 A si era accumulato nelle cellule CD68+.
7:
Le analisi FACS hanno rivelato che le cellule peritoneali positive per il marcatore dei macrofagi F4/80 espresso nell’ aumento dei livelli di Sema 4 A sotto
trattamenti di tioglicollato. Di fatti , il numero di cellule peritoneali esprimenti Sema 4 A è cresciuto dall’ 8% a 48 e 58% , rispettivamente 24 e 48 ore dopo l’ iniezione di tioglicollato. Questo aumento dell’ espressione di Sema 4 A nelle cellule
peritoneali 24 e 48 ore dopo il trattamento a base di tioglicollato è stato confermato dall’ analisi western-blot. In seguito abbiamo investigato sull’ espressione dei recettori Sema 4 A in queste cellule peritoneali.
È interessante notare come la plexina D1 e la plexina B2 espressa in maniera significante nelle cellule controllo è stata fortemente up-regulated nei macrofagi nell’ arco di 24 e 48 ore di trattamento tioglicollato.
È stato mostrato che in caso di infiammazione , diversi tipi di cellule infiammatorie , inclusi i macrofagi , hanno aumentato l’ espressione Tim-2 , che è uno dei
recettori Sema 4 A.
Mentre abbiamo osservato un’ espressione significante di Tim-2 nei macrofagi controllo e in quelli Sema 4 A-stimolati in maniera differente dagli altri due recettori , non abbiamo individuato un aumento significativo di Tim-2 dopo lo stimolo
infiammatorio confrontandolo con cellule non trattate. I monociti circolanti possono essere raggruppati in sottoinsiemi di infiammatori e residenti , dipendenti dal livello di espressione del marcatore LY6C.
Quando l’ espressione Di Sema 4 A delle cellule in superficie è stata analizzata dal flusso citometrico su LY6C high e LY6C low dei sottoinsiemi periferici di monociti del sangue , più alta in LY6C high che nei monociti LY6C low . Entrambi nei topi controllo e tioglicollato- trattati . inoltre il tioglicollato regola positivamente l’ espressione di Sema 4 A nei monociti LY6C high ma non nelle cellule LY6C low. Questi dati suggeriscono che Sema 4 A segue un percorso specifico in
relazione ai monociti circolanti infiammatori che possono migrare nella sezione del tessuto danneggiato.
;<
SEMA 4 A AUMENTA L’ ESPRESSIONE VEGF-A NEI MACROFAGI
UMANI ATTRAVERSO LA PLEXINA D1.
Per studiare in maniera più approfondita il coinvolgimento di Sema 4 A nella risposta dei macrofagi , abbiamo studiato i suoi effetti sull’ espressione dei geni codificanti gli induttori chemochine e angiogenici. Sema 4 A ha up- regolato selettivamente VEGF-A , e in maniera minore , IL-8 , mentre non ha modificato l’ espressione di altri fattori angiogenici e chemochine comparati con controlli. Coerentemente alle analisi dell’ espressione dei geni , abbiamo individuato un aumento dell’ espressione (della proteina) VEGF-A nei macrofagi lisati e
supernatanti trattati con Sema 4 A. L’ ipossia regola l’ angiogenesi ed è un forte induttore della produzione di VEGF-A. In accordo di dati esposti in precedenza , l’ ipossia regola positivamente l’ espressione basale e LPS-stimolata di VEGF-A , ma non mostra alcun effetto sinergico nell’ up regulation di VEGF-A prodotta in condizioni normossiche da Sema 4 A.
Per valutare il meccanismo cellulare dell’ aumento dell’ espressione VEGF-A indotto da Sema 4 A è stato investigato se questo effetto è stato mediato da plexina D1 o plexina B2.
Come individuato da ELISA è stato osservato che la plexina D1 , ma non la plexina bloccante B2 , e ABS hanno fortemente ridotto la crescita dei livelli VEGF- A , indotti da Sema 4 A endogeno e esogeno nei macrofagi supernatanti e nelle cellule lisate. Quindi questi dati indicano che Sema 4 A induce l’ espressione VEGF-A attraverso un percorso plexina –mediato e che la plexina D1 gioca un ruolo critico nel mediare gli effetti di Sema 4 A .
Dato che VEGF-A aumenta l’ attività dei monociti e dei macrofagi e innesca la loro mobilità , noi valutiamo se Sema 4 A è capace di aumentare la funzione dei
macrofagi attraverso l’ attivazione VEGFR-1 E VEGFR-2. Le analisi western-blot di macrofagi lisati esposti o no a Sema 4 A mostrano a mala pena livelli
rintracciabili di fosfo-VEGFR-2 nelle cellule controllo e Sema 4 A-stimolate. È da notare come Sema 4 A abbia indotto un’ aumento della fosforilazione
VEGFR-1. Questi dati suggeriscono che l’ aumento dell’ attivazione VEGFR-1 può essere in parte legato all’ effetto pro migratorio sui macrofagi.
=>