A è ESPRESSO IN MANIERA SPECIFICA DAI PRECURSORI MIELOIDI E DA MACROFAGI MATURI NEL CUORE COLPITO DA

INFARTO.

Per capire meglio il coinvolgimento di Sema 4 A nell’ ischemia cardiaca dopo I/R , abbiamo indagato sulla localizzazione della proteina Sema 4 A e la sua espressione in diversi momenti dopo la riperfusione tramite un’ analisi confocale al microscopio. Sema 4 A non era espresso nel cuore non colpito da infarto ( setto interventricolare e ventricolare destro) , ma la sua espressione è stata prontamente individuata nella parete libera infartuata e necrotica del ventricolo destro. Da notare che Sema 4 A non era individuabile nel cuore dei topi controllo sham-operati.

In seguito abbiamo esaminato l’ espressione del pattern Sema 4 A in differenti tipi di cellule , che possono essere trovate all’ interno del tessuto cardiaco infartuato , e abbiamo notato che questa proteina non si colocalizza con i cardiomiociti a- actina o con gli EC vascolari CD 31+. In base alle macchie sparpagliate di Sema 4 A , abbiamo valutato la sua espressione nei diversi sottoinsiemi dei leucociti reclutati. 24 ore post I/R , Sema 4 A non si colocalizza con le cellule LY6G+ , CD4+, CD8+, o CD11c + .

Al contrario , SEMA 4 A era espresso da CD11b+ e da un sottoinsieme di cellule CD68+ infiltrate nel tessuto 24 ore dopo L/R . A 48 ore di distanza dall’ I/R , quando la maggior parte delle cellule CD11b+ erano rimpiazzate da macrofagi maturi CD68+ , Sema 4 A era per lo più localizzato in queste cellule.

Inoltre dopo 48 ore , Sema 4 A colocalizzato con le cellule CD11b+ non ancora differenziate nei macrofagi meno estese , con le cellule LY6G+. Dei risultati simili sono stati ottenuti utilizzando anti-F4/80 Ab a 24 e 48 ore dall’ I/R. Presi insieme questi dati indicano che Sema 4 A è prodotto dai macrofagi maturi reclutati nelle

CC

zone colpite e suggeriscono che può giocare un ruolo importante nel regolare le loro funzioni durante l’I/R cardiaco.

DISCUSSIONI.

Nel corso dell’ ultimo anno , un insieme crescente di dati ha dimostrato un ruolo importante dei Sema e dei suoi recettori nella regolazione delle funzioni cellulari legate all’ angiogenesi e all’ immunità . Tra queste , Sema 4 A regola la funzione dendritica delle cellule e dei linfociti T e inibisce la migrazione EC e l’ angiogenesi sperimentale , anche se il suo ruolo nell’ interazione tra i processi angiogenici e infiammatori è ancora poco chiaro.

Utilizzando approcci in vitro e modelli in vivo di infiammazione peritoneale e di ischemia cardiaca , abbiamo scoperto in questo studio un nuovo ruolo di Sema 4 A nella regolazione della funzione dei macrofagi in relazione all’ angiogenesi e all’ infiammazione.

In questo studio abbiamo mostrato che il fattore esogeno Sema 4 A stimola la migrazione dei macrofagi in maniera dose dipendente . Inoltre , abbiamo scoperto che la plexina D1 è la plexina più up regolata nei macrofagi umani stimolati con LPS e poli I:C , suggerendo il suo potenziale coinvolgimento nella risposta dei macrofagi a Sema 4 A durate i processi infiammatori. In maniera considerevole, l’ anti-plexina D1 bloccante Ab , ma non l’ anti plexina B2 è abrogata dall’ effetto migratorio di Sema 4 A. Osservare il fatto che Sema 4 A aumenta leggermente l’ espressione di IL-8 , ma non cambia in modo significativo quello dei livelli delle chemochine infiammatorie testate , ha suggerito che il suo effetto chemiotattico , a differenza da quanto descritto in precedenza per gli altri attivatori dei macrofagi , può essere diretto. Il ruolo cruciale della plexina D1 nel mediare gli effetti pro migratori di Sema 4 A è ulteriormente corroborata dalla scoperta che Sema 4 A ha inibito la migrazione EC VEGF-A -mediata attraverso l’ espressione della plexina D1 nell’ endotelio.

L’ inibizione della funzione della plexina D1 ha fortemente ridotto la migrazione basale dei macrofagi , suggerendo che Sema 4 A endogeno possa essere coinvolto nella funzione pro migratoria .

DE

Saranno necessari ulteriori studi per chiarire i percorsi di segnalazione innescati da Sema 4 A nei macrofagi e il suo possibile ruolo come regolatore endogeno in relazione al comportamento dei macrofagi. È noto il fatto che , insieme al Sema 4 A , Sema 3E lega direttamente la plexina D1 e regola la crescita tumorale , la disseminazione e l’ angiogenesi.

Dunque , noi abbiamo indagato al fine di scoprire se Sema 3E , come Sema 4 A , fosse anche capace di promuovere la motilità dei macrofagi. Abbiamo notato che a differenza di Sema 4 A ,Sema 3E non aumenta la migrazione dei macrofagi e l’ espressione di Sema 3E non era cresciuta nelle cellule attivate.

Inoltre , i nostri dati relativi ai trattamenti simultanei dei macrofagi con Sema 4 A e Sema 3E in presenza della plexina D1 – bloccante Ab , suggeriscono una competizione tra i due Sema per il recettore plexina D1. Pur non avendo riscontrato un aumento significativo dell’ espressione di Sema 3E nei macrofagi attivati , possiamo ipotizzare che i livelli più bassi di Sema 3E prodotti dai macrofagi sono sufficienti a contrastare gli effetti di Sema 4 A nella migrazione basale.

Le nostre scoperte rivelano un ruolo cruciale e specifico di Sema 4 A nello aumento della motilità dei macrofagi attivati e suggerisce che la competizione con Sema 3E possa regolare l’ attività dei macrofagi durante l’ infiammazione o

l’ angiogenesi patologica.

Mentre eravamo alla ricerca di ulteriori meccanismi in cui Sema 4 A può regolare i macrofagi , abbiamo notato che la stimolazione di queste cellule con Sema 4 A ha indotto una fosforilazione significante di VEGFR-1 , ma non di VEGFR-2. È stato dimostrato che VEGFR-1 è il principale recettore che regola la motilità VEGF-A stimolato dei monociti/macrofagi.

Inoltre VEGFR-1 media l’ attivazione e il reclutamento di queste cellule durante l’ infiammazione cronica e l’ angiogenesi patologica.

In base a queste scoperte e ai nostri dati , possiamo sostenere che la crescita dell’ attivazione di VEGFR-1 indotta dal percorso Sema 4 A/ plexina D1 e il conseguente legame con VEGF-A prodotto dai macrofagi o da altri tipi di cellule , può essere parte del meccanismo in cui Sema 4 A esercita il suo effetto pro migratorio sui macrofagi. Di recente è stato inoltre scoperto che Sema 4 A è capace di legarsi a tutte e tre le plexine (plexina B1,B2,B3) , e le plexine hanno

FG

mostrato la loro capacità di mediare il collasso del cono di crescita di Sema 4 A- indotto nei neuroni dell’ ippocampo del topo.

In questo studio abbiamo mostrato che tra le differenti plexine B , i macrofagi stimolati con poly I:C e LPS mostrano una crescita dei livelli di plexina B2 , ad ogni modo una funzione Ab bloccante diretta contro questo recettore non inibisce la chemiotassi Sema 4 A-stimolato dei macrofagi. È interessante indagare su come questo recettore possa mediare le altre funzioni o agire come un recettore esca.

Tra i diversi fattori angiogenici analizzati , nello specifico Sema 4 A attiva la trascrizione del gene VEGF-A nei macrofagi.

VEGF-A è un marcatore dei macrofagi attivati in maniera alternata (M2) con un ruolo ben definito nel rimodellamento dei tessuti , nell’ angiogenesi e nella progressione tumorale. È stato ampiamente descritto che i macrofagi associati al tumore condividono diverse proprietà con le cellule M2 attivate , hanno un ruolo di propulsione nell’ angiogenesi tumorale , e inducono la progressione del cancro. Ad esempio è stato mostrato che i macrofagi associati al tumore esprimenti una matrice metalloproteinasi-9 stimolano l’ attivazione angiogenica e la progressione tumorale rilasciando VEGF-A dalla matrice extracellulare in modelli di topi transgenici. La matrice metalloproteinasi-9 era fortemente espressa , ma non modulata in maniera significativa , nei macrofagi Sema 4 A –stimolati e quelli non stimolati , suggerendo che altre proteasi possono essere coinvolte nella regolazione dell’ angiogenesi VEGF-A indotta. Al contrario Sema 4 A non modula in maniera significativa la signature infiammatoria dei macrofagi , facendo eccezione per IL-8 , il quale gioca un ruolo rilevante nel processo angiogenico. È stato ampiamente dimostrato che l’ ipossia ha indotto l’ espressione di VEGF-A nei macrofagi. I nostri dati mostrano però che l’ ipossia non è coinvolta

nell’ aumento dell’ espressione VEGF-A indotta da Sema 4 A.

Inoltre abbiamo dimostrato che Sema 4 A induce l’ espressione di VEGF-A attraverso la plexina D1. È stato descritto che uno dei principali meccanismi di induzione della produzione di VEGF-A nei macrofagi coinvolge un percorso NF-kB – dipendente.

Quindi possiamo sostenere che Sema 4 A , attraverso la plexina D1 , percorsi di ipossia indipendenti , portando alla sovraespressione di VEGF-A per opera

HI

dell’ attivazione di NF-kB. TGF beta1 è stato di recente coinvolto nell’ up regulation dei VGFR e nell’ espressione di VEGFR-A nei macrofagi e nelle cellule dendritiche attraverso Smad3/4. In base alle nostre scoperte che descrivono l’ attivazione di VEGFR-1 nei macrofagi sotto la stimolazione di Sema 4 A esogeno , possiamo ipotizzare che l’ attivazione del percorso di segnalazione di TGF-beta1/Smad , può rappresentare un meccanismo alternativo attraverso il quale Sema 4 A up regola l’ espressione di VEGF-A in queste cellule.

L’ aumento della migrazione di EC e la formazione dei vasi in vivo indotta da macrofagi trattati con Sema 4 A ricombinante è coerente con l’ induzione di Sema 4 A di un proangiogenico fenotipo nei macrofagi.

È stato recentemente descritto che Sema 4 A inibisce le funzioni degli EC nelle angiogenesi sperimentali. In questo studio abbiamo descritto come Sema 4 A possa esercitare un effetto proangiogenico indiretto mediato dai macrofagi che stimolano la migrazione EC.

È interessante notare come sia stato descritto un effetto simile ma opposto dei Sema. Ad esempio è stato mostrato che Sema 3B , indicato come un putativo soppressore tumorale , il quale inibisce la crescita del tumore e l’ angiogenesi , ha indotto il reclutamento dei macrofagi tumore-associati e una conseguente attivazione del programma pro metastatico.

Basandoci sui nostri dati che descrivono come Bevacizumab abbia completamente annullato la migrazione EC e la formazione dei vasi in vivo , indotta dai macrofagi Sema 4 A trattati , possiamo sostenere che durante

l’ angiogenesi patologica , Sema 4 A può promuovere la neovascolarizzazione reclutando macrofagi esperimenti VEGF-A al fine di attivare gli EC.

In questo articolo mostriamo che VEGF-A prodotto dai macrofagi Sema 4 A indotto attiva uno specifico percorso segnale negli EC, aumentando i livelli di phospho-Akt.

È stato ampiamente descritto che i percorsi PI3k/Akt possono regolare la migrazione endoteliale , la proliferazione e la sopravvivenza attraverso l’ effetto dei suoi target dowstream , come la sintasi NO endoteliale , proteina ribosomiale P70 S6 1 chinasi , e il fattore forkheadbox 01 che regolano l’ angiogenesi tumorale. Inoltre l’ attivazione endoteliale Akt provoca la comparsa di una vascolatura allargata e fortemente permeabile che riassume il fenotipo anormale-strutturale e funzionale del tumore dei vasi sanguigni. In base ai nostri dati è possibile

JK

ipotizzare che l’ induzione di un fenotipo pro angiogenico nei macrofagi da parte di Sema 4 A , provoca l’ attivazione del percorso endoteliale P I3K /Akt portando ad un aumento della migrazione EC e un aumento della formazione dei vasi in vivo che può essere cruciale per l’ angiogenesi nel cancro e in altre condizioni patologiche. Abbiamo rintracciato un quantitativo considerevole di Sema 4 A nel medium di coltura di diversi macrofagi umani , corroborando le osservazioni precedenti e dimostrando che una forma solubile di Sema 4 A è attaccata da Sema 4 A legato alla membrana espresso nei reni embrionali umani 293.

Questi dati indicano quindi che Sema 4 A può essere espresso come mediatore solubile e che esercita la sua funzione pro migratoria sui macrofagi come proteine rilasciate localmente. Quindi gli effetti finali di Sema 4 A sull’ angiogenesi , risultano da un bilancio omeostatico tra le attività anti e pro angiogeniche , rispettivamente mediate dall’ effetto diretto sugli EC e i macrofagi. È stato ampiamente mostrato come durante l’ I/R cardiaco i monociti/macrofagi giocano un ruolo cruciale nella fagocitosi del miocardio necrotico e nella risposta infiammatoria necessaria per la salute del tessuto.

Noi mostriamo in questo studio per la prima volta , che Sema 4 A è espresso in maniera specifica dai macrofagi reclutati nella zona infartuata e che ha aumentato significativamente la migrazione dei macrofagi , suggerendo che Sema 4 A può essere coinvolto nel reclutamento e nella attivazione di un sottoinsieme di macrofagi che contribuiscono ad un primo rimodellamento del tessuto dopo un I/R. Svolgendo un’ analisi più ampia sull’ espressione del gene dei segnali d’ azione guida degli assoni , nelle prime fasi dell’ ischemia cardiaca , abbiamo rilevato una modulazione significante di diversi Sema nel corso dello sviluppo dell’ infortunio. È interessante notare come nelle prime fasi i membri di classe 3 , come Sema 3 A, Sema 3E e Sema 3F , noti per essere rilevanti nell’ angiogenesi patologica , erano up regolati. Questo ci ricorda le osservazioni fatte in relazione ai modelli di topo colpiti da tumore, nei quali era possibile notare che gli inibitori angiogenici Sema 3 A e Sema 3F erano up regolati per bilanciare la produzione prominente degli induttori angiogenici.

Inoltre , Sema 6 A , un’ altro inibitore angiogenico , e Sema 7 A , un mediatore della risposta infiammatoria delle cellule T- mediate , erano anche loro up regolati. Presi insieme , questi dati suggeriscono un ruolo complesso di Sema nella

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riparazione dei tessuti dei danni ischemici. Questo concetto è supportato ulteriormente dalla persistente espressione di un alto livello di Sema 4 A , sia all’ inizio che durante il processo I/R. Verranno comunque svolti ulteriori studi al fine di comprendere questo nuovo ruolo di Sema 4 A nell’ angiogenesi e nelle condizioni patologiche. Per concludere , il nostro studio svela un nuovo ruolo svolto da Sema 4 A nell’ indurre un programma genetico ristretto nei macrofagi capace di sostenere l’ angiogenesi.

In base alle nostre osservazioni in vitro e in vivo è concepibile ipotizzare che nelle zone colpite da un’ infiammazione o durante l’ angiogenesi patologica come in I/R , Sema 4 A può reclutare i macrofagi dal tessuto ischemico tumorale in modo da regolare la risposta angiogenica necessaria per la salute del tessuto e il suo rimodellamento. L’ aumento dell’ espressione di Sema 4 A può quindi contribuire all’ attivazione dell’ inizio del processo di angiogenesi mediante uno specifico aumento dell’ espressione di VEGF-A nei macrofagi infiltrati.

Cap. 4 LIVELLI DI SEMA 4D PLASMA SOLUBILE AUMENTATI NEI