UNIVERSIT
À
DI PISA
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Specialistica in Farmacia
Tesi di laurea
La segnalazione delle semaforine
nello sviluppo cardiovascolare.
Relatore: Candidata:
Prof. Antonio Lucacchini Maria Linda Gordiani
1
INDICE
Cap 1.
La segnalazione delle semaforine nello sviluppo cardiovascolare. 2
Cap 2 .
Il recettore neutrofina P 75 , le semaforine e la circolazione nel cuore. 18
Cap 3.
La semaforina 4 A esercita un effetto proangiogenico accrescendo
l’ espressione del fattore A di crescita vascolare endoteliale. 26
Cap 4.
Livelli di Sema 4 D nel plasma solubile aumentati nei pazienti con
insufficienza cardiaca.
49
Cap 5.
Disturbi congeniti e la segnalazione delle semaforine:
2
Cap 1. LA SEGNALAZIONE DELLE SEMAFORINE NELLO SVILUPPO
CARDIOVASCOLARE.
Le semaforine furono originariamente identificate come molecole guida dei neuroni che interpongono il loro segnale di attrazione o repulsione creando complessi con i recettori della plexina e della neurofilina.
Alcune ricerche svolte in seguito hanno identificato delle funzioni di segnalazione delle semaforine in diversi organi e tessuti al di fuori del sistema nervoso.
È stato dimostrato che la semaforina svolge ruoli significativi nel modello vascolare e nella morfogenesi cardiaca , inoltre la segnalazione impari delle semaforine segnale è stata associata a vari disordini cardiovascolari umani , tra cui la artrosi persistente del tronco , la bradicardia e connessioni venose
polmonari anomale.
In questa tesi di laurea studieremo le funzioni delle semaforine e dei loro recettori nello sviluppo e nei disturbi cardiovascolari evidenziando le scoperte avvenute di recente in questo campo.
3
INTRODUZIONE.
Le semaforine sono una grande famiglia di glicoproteine associata alla membrana altamente conservate sia strutturalmente che funzionalmente attraverso l’
evoluzione dai virus ai mammiferi.
Le semaforine e i recettori della neurofilina sono stati inizialmente identificati come molecole guida degli assoni nello sviluppo del sistema nervoso. Successivamente è stato dimostrato che queste operano in un largo range di processi di sviluppo , psicologici e patologici fuori del sistema nervoso centrale , che includono:
attivazione dei linfociti , migrazioni delle cellule della cresta neuronale , mobilitazione delle cellule dell’ endotelio vascolare , crescita dell’ osso ,
angiogenesi , sviluppo dei tumori , morfogenesi delle diramazioni polmonari e sviluppo cardiovascolare.
I segnali della semaforina agiscono attraverso meccanismi paracrini e autocrini i quali modulano il comportamento cellulare e che sono suddivisi in otto classi. Le semaforine di classe 1 e 2 si trovano negli invertebrati , le classi da 3 a 7 si trovano nei vertebrati e la classe 8 nei virus. Nonostante che differiscono nella sequenza aminoacidica e in generale nelle caratteristiche strutturali, tutti i membri della famiglia delle semaforine contengono un dominio extracellulare N-terminale di circa 500 aminoacidi detto Sema.
I domini Sema di alcune semaforine differenti tra loro sono stati recentemente caratterizzati da mutagenesi ,cristallografia e raggi x , e il modellismo 3D , rivelano che il dominio Sema è una variante dei sette foglietti a paletta della beta elica con somiglianze strutturali alle ripetizioni dell’ elica beta dell’ alfa integrina.
Le diverse classi di semaforine sono caratterizzate da motivi strutturali specifici per ogni classe. Per esempio , le classi da 2 a 7 contengono una singola copia di un dominio come immunoglobuline , mentre la classe 5 delle semaforine contiene 7 copie di dominio trombospondino. Tutte le semaforine dei vertebrati e degli invertebrati contengono un dominio plexina-semaforina-integrina (PSI) richiesto per l’ omodimerizzazione.
Un’ altra importante caratteristica che differisce nelle diverse classi di semaforine è la presenza delle sequenze ancorate alla membrana ; mentre la classe 2 e 3 sono proteine secrete , le classi 1,4,5 e 6 sono proteine intrinseche e la classe 7 proteine ancorate alla membrana , le quali possono essere ulteriormente elaborate in proteine solubili mediante sfaldamento proteolitico.
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Sono state identificate due famiglie di recettori di semaforine : le plexine e le neurofiline. Le prime sono una famiglia conservata di grandi proteine ( circa 200 KDA) , inizialmente identificate come molecole di superficie cellulare medianti adesione. Sono stati identificati nove membri nei vertebrati i quali sono ulteriormente suddivisi in quattro classi : classe A ( plexine A1 ,A2 , A3, e A4) classe B ( plexina B1, B2 e B3) , classe C ( plexina C1) e classe D ( plexina D1) . A differenza delle semaforine , l’ architettura delle plexine è conservata in tutta la famiglia . Il dominio extracellulare delle plexine contiene un Sema dominio seguito da 3 PSI e tre Ig-like , plexine , e le repliche dei fattori di trascrizione . Il Sema dominio agisce come un elemento auto inibitorio che modula l’ attivazione delle plexine oltre al ligando vincolante.
Il dominio IPT gioca un importante ruolo nella interazione proteine-proteine. I domini intracellulari delle plexine contengono due segmenti che mostrano
sequenze simili alla famiglia specifica RAS della guanosina trifosfasi ( GTP ase ) proteine di attivazione (RasGAP) . Questi segmenti si incrociano per formare un dominio GAP intatto molto simile al GAP dominio delle P120 RasGAP. Il dominio GAP è separato da una regione collante che include il dominio legante Rho GTPase (RBD). Tre Rho della famiglia di GTPasi, Rac1 ,Rnd 1 e RhoD hanno mostrato la capacità di legare l’ RBD dei recettori delle plexine. L’ alterazione dei due residui di arginina conservati che corrispondono ai residui catalitici invarianti dei Ras GAPs , che aboliscono le risposte cellulari mediate dalla plexina , indica che i domini GAP sono essenziali per segnalare la plexina. Questo suggerisce che l’ attività GAP della plexina richiede due circostanze simultanee: il collegamento a un ligando della semaforina al dominio extracellulare e l’ unione al Rho GTPase dell’ RBD.
Recentemente le strutture cristalline dell’ RBDs dei vari recettori della plexina dimostrano che questa regione ha una piega come l’ubiquitine , che è anche presente nel RAS-GAPs.
Sebbene le plexine mostrino l’ analogia strutturale con i recettori della tirosina chinasi come C-MET , questi non hanno la stessa attività della tirosina chinasi. Molte semaforine legate alla membrana si attaccano direttamente ai recettori della plexina. Comunque , questo non è il caso delle semaforine di classe 3 , facendo eccezione per la semaforina 3e corecettore della neurofilina ( Nrp1/ Nrp2) per trasdurre il loro segnale ai recettori della plexina.
5
Le neurofiline sono corecettori promiscui per quanto riguarda sia ligandi che i recettori partner , i quali partecipano ad un’ ampia gamma di vie di segnalazione. Soprattutto per quanto riguarda il sistema cardiovascolare , le neurofiline possono associarsi al recettore del fattore di crescita dell’ endotelio vascolare (Vegf) per mediare la segnalazione angiogenetica Vefg alle cellule endoteliali.
Le anomalie cardiovascolari associate ai difetti delle semaforine segnale sono stati riportati in tabella 1 e 2.
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Table 1. Semaphorin Ligand Mutants with Cardiovascular Defects
VSD: ventricular septal defect; PTA: persistant truncus arteriosus; ASD: atrial septal defect
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Table 2. Semaphorin Receptor Mutants with Cardiovascular Defects
BAE: Bilateral atrial enlargement; AOC: anomalous origin of the coronary arteries; VSD: ventricular septal defect; PTA: persistent truncus arteriosus.
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semaphorins and others
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8
SVILUPPO CARDIOVASCOLARE: UNA PANORAMICA.
Il cuore è il primo organo funzionale a formarsi durante l’ embriogenesi . Lo sviluppo del cuore comincia con la migrazione dei precursori mesodermali dalla prima vena per poi formare una struttura a forma di arco ( cardiac crescent) . Questa regione può essere separata all’ interno del primo campo del cuore , il che genera il tubo cardiaco lineare e , nel secondo bacino del cuore , che dà forma alle porzioni dell’ atrio , il tratto di efflusso , e il ventricolo destro .
Inizialmente il cuore è composto da due strati : uno più interno l’ endocardio e uno più esterno il miocardio. Successivamente , lo strato del miocardio si espande e le cellule progenitrici pro epicardiali migrano sulla superficie del cuore , facendo contribuire i fibroblasti a invadere lo strato miocardico , quindi a formare lo strato epicardiale più esterno. Complessi movimenti morfogenetici asimmetrici collegati con un irregolare tasso di crescita contribuiscono alla formazione delle cavità. Una serie di eventi hanno luogo in un cuore dotato delle 4 cavità in piena funzione integrati dalla circolazione polmonare e sistemica .
Questo processo è facilitato dalle cellule della cresta neuronale , che migrano dal tubo neuronale dorsale e invadono il tratto di efflusso cardiaco , contribuendo alla muscolatura liscia dei grandi vasi necessari alla innervazione del cuore.
Nel momento in cui il cuore si forma , le cellule endoteliali progenitrici si fondono a formare un plesso primitivo vascolare e si connettono anche con un’ altro per formare dei tubi ( vasculogenesi). La crescita del ramo dei vasi , si espande , i quali si fanno spazio in modelli stereotipati sotto l’ influenza di fattori di crescita estrinsechi come Vegf e varie molecole guida , incluse le semaforine . L’ endotelio venoso e arterioso assume identità uniche caratteristiche di espressione genica. Il sistema vascolare linfatico emerge dai vasi venosi , includendo la vena
cardinale e matura in un modello di sistema vascolare tipico che drena il fluido extracellulare e i costituenti cellulari degli organi e dei tessuti periferici , riportando linfa verso il sistema sistemico venoso .
Nel corso degli ultimi anni , una crescente documentazione induce a pensare che le semaforine segnale in molti aspetti dello sviluppo cardiovascolare, e un
crescente numero di disordini sono stati associati con le mutazioni genetiche o variazioni dei percorsi dei geni della semaforina segnale.
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COMPATTAZIONE E TRABECOLAZIONE MIOCARDICA.
Un essenziale processo nello sviluppo cardiaco è la maturazione degli atrii , e i difetti in esso possono portare a una varietà di anomalie congenite che includono la non compattazione , disfunzioni sistoliche , disfunzioni diastoliche e l’ aritmia . Durante lo sviluppo della camera il miocardio è costituito da due strati: uno compatto esterno e uno strato interno trabeculato ( non compatto).
Il miocardio trabeculato è coperto dall’ endocardio e l’ interazione tra questi due strati è essenziale per la proliferazione e differenziazione cardiomiocita .
La non compattazione del ventricolo sinistro (LVNC) è un disordine di maturazione cardiaca molto studiata caratterizzata da un miocardio
estensivamente trabeculato del ventricolo sinistro e una sottile zona compatta. LVNC può portare all’ insufficienza cardiaca ,ictus, aritmie ventricolari e o improvvisa morte cardiaca.
Toyofuku e altri dimostrarono che l’ interazione Sema 6d- Plxna1 è richiesta per lo sviluppo della camera cardiaca Sema 6d ed è espresso nelle cellule miocardiali compatte e trabeculate ; comunque il suo recettore Plxna1 è espresso dal miocardio trabeculato e dalle cellule endocardiali.
Ulteriori esperimenti suggeriscono che Sema 6d legato alla membrana può funzionare sia come un ligando sia come un recettore per Plxna1 al fine di modulare l’ espansione e la trabecolazione dello strato compatto.
Sorprendentemente , Sema 6d dei topi knockout sono disponibili e non mostrano problemi cardiaci rilevanti. È possibile che la semaforina svolga altri ruoli aggiuntivi nella maturazione miocardica . Per esempio , Sema 3 a dei topi mutanti evidenzia la presenza di un anormale ventricolo destro e di un abnorme miocardio atriale.
LA CRESTA NEURONALE E LA GITTATA CARDIACA.
Nella regolazione specifica sono implicati molti processi di segnalazione: induzione , migrazione , proliferazione , differenziazione e sopravvivenza delle cellule della cresta neuronale cardiaca. La rottura della cresta neuronale cardiaca durante lo sviluppo porta a forme specifiche di malattie congenite del cuore , tra cui l’ interruzione dell’ arco aortico , tronco arterioso persistente (PTA).
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Vari studi hanno dimostrato che le semaforine –plexine segnale possono regolare la migrazione delle cellule cardiache della cresta neuronale nella formazione del cuore . Sema 3c è espresso nell’ arco mesenchimale e brachiale OFT attraverso il processo di divisione e rimodellamento. I danni genetici del Sema 3 C sono causa di morti post natali dovute al PTA ( tronco arterioso persistente) , difetti del setto ventricolare e interruzione dell’ arco aortico.
L’ analisi molecolare mostra alcune migrazioni anormali delle cellule della cresta neuronale cardiaca nel Sema 3c , embrioni di topi associati con l’ espressione anomala di Foxc1 , EDNRA e Plxna2 della cresta neuronale. L’ OFT e i difetti dell’ arco aortico nei mutanti Sema 3c sono simili alla cresta neuronale asportata agli embrioni dei pulcini , suggerendo che l’ espressione del Sema 3c è
essenziale per lo sviluppo dell’ OFT e il modello dell’ arco aortico .
Recenti lavori negli embrioni dei pulcini suggeriscono che la migrazione delle cellule della cresta neuronale cardiaca è determinata da due segnali d’ azione di repulsione e attrazione provocato dalle semaforine. Sema 3 C genera segnali di attrazione mentre Sema 6 a e Sema 6 b legati alla membrana possono dar vita a segnali di repulsione per migrazione verso la cresta neuronale.
Comunque , Sema 3 c è anche espresso dalla migrazione della cresta neuronale cardiaca e può segnalare l’ espressione dell’ endotelio circostante esprimendo Plxnd1 e Nrp 1 / 2 avendo come risultato una serie reciproca di cascate differenti che infine colpisce il modello e la differenziazione della cresta neuronale.
L’ espressione del Sema 3c della cresta neuronale cardiaca è GATA6 dipendente e le mutazioni del GATA6 nei topi e negli umani sono associate con malattie congenite del cuore tra cui la PTA.
Ulteriori studi che utilizzano topi geneticamente modificati implicano sempre di più le semaforine segnale nella cresta neuronale cardiaca e nel deflusso dello
sviluppo del tratto. Plxna2 , che può agire come un recettore per il Sema , è espresso dalla migrazione della cresta neuronale cardiaca , e la sua perdita di espressione nei topi viene evidenziata nella migrazione alterata e nelle anomalie cardiovascolari , che include PTA e l’ assenza della sezione dell’ arteria aortica e polmonare. La perdita di Plxna2 porta all’ up regulation della plexina A4 nell’ OFT portando una risposta compensatoria , e a dei doppi mutanti della Plxna2 e Plxna4 mostrano dei difetti OFT con una infiltrazione maggiore alla Plxna2 -/- dei topi.
Recentemente è stato dimostrato che l’ attivazione del gene Plxna2 specifico della cresta neuronale è Brg1 ( BRAHMA-RELATED GENE 1) dipendente.
Brg1 è una sub unità ATPasica del complesso Brg1/BAF rimodellante la cromatina , il quale interagisce al promotore Plxna2 con il Chd7 , che è codificato da un gene mutato negli umani con la sindrome di CHARGE caratterizzata da difetti OFT. Mutanti Brg1 specifici della cresta neurale mostrano anche difetti nella formazione dell’ OFT e Plxnd1 è espresso dalle cellule dell’ endotelio durante lo sviluppo cardiovascolare . Plxnd1 –null-pups e knockouts Plxnd1 specifici dell’ endotelio muoiono bruscamente dopo la nascita dovuta al PTA , a difetti delle arterie dell’ arco aortico e a difetti del setto ventricolare. Le mutazioni di Plxnd1 sono state associate a casi isolati del tronco arterioso negli umani.
Un recente studio svolto da Worzfeld e altri dimostra che le mutazioni
transgeniche dei topi harboring nel dominio GAP di Plxnd1 riassumono il fenotipo dei Plxnd1-null topi , suggerendo che il dominio GAP è essenziale per segnalare Plxnd1 , durante lo sviluppo cardiaco. Plxnd1 può interagire con NRP1 per trasdurre un segnale SEMA 3c , ma lo spettro dei ligandi Plxnd1 è già
ampiamente definito , e resta oscuro il meccanismo attraverso il quale la perdita del segnale Plxnd1 nell’ endotelio ha luogo nei difetti OFT . Una volta conosciuti i ruoli dei segnali notch nella formazione dell’ OFT , è interessante ipotizzare che la perdita di Plxnd1 porta ad un segnale anormale di notch dall’ endotelio al
circostante mesenchima , includendo la cresta neurale ; tuttavia questa ipotesi va ancora verificata. Difetti cardiaci simili al mutante Sema 3c , Plxna2 , e Plxnd1 sono stati descritti nel knockout dell’ Nrp1 e topi knockout Nrp1 specifico dell’ endotelio.
Comunque PTA non è osservato nei topi che esprimono una forma di neurofilina 1 incapace a legarsi alla classe 3 delle semaforine ( Nrp1 Sema) suggerendo che NRP1 Sema indipendente che segnala nelle cellule dell’ endotelio essenziale per la divisione di OFT è interessante come lo sfondo di NRP1 sema topi NRP2 –null mostri PTA , suggerendo al ridondanza funzionale . Dato che Nrp1 possono legarsi al VEGF in affinità alle semaforine , è possibile che Nrp1 che segnala VEGF – dipendente , moduli lo sviluppo OFT per questi risultati.
Tuttavia recenti studi hanno verificato che il fenotipo di un topo mutante Nrp1 nel quale Nrp1 era mutato abolisce specificatamente il legame VEGF. Il risultante topo Nrp1 VEGF sopravvive fino all’ età adulta e non mostra difetti OFT.
La relativa influenza di VEGF verso le semaforine che segnalano attraverso neurofilina è quindi ormai chiara.
SVILUPPO EPICARDICO.
Lo strato epicardiale del cuore è derivato da una struttura transitoria chiamata organo pro epicardiale (PEO) che nasce dal mesotelio del setto trasverso.
Durante lo sviluppo embrionale, l’ epicardio fornisce cellule progenitrici che danno luogo a vari lignaggi cardiaci , includendo fibroblasti , endotelio e muscolatura liscia , con importanti contributi al vascolare coronarico.
L’ epicardio gioca anche un importante ruolo nei danni cardiaci e nelle sue
riparazioni. L’ operato del gene embrionale nell’ epicardio è attivato dopo il danno miocardiale e i fattori sono rilasciati dall’ epicardio attivato i quali influenzano la riparazione e la rigenerazione cardiaca.
La contribuzione pro epicardiale al lignaggio cardiaco è stata controversa , con risultati contrastanti nei modelli di topi e pulcini. Il PEO è un tessuto eterogeneo composto da sub popolazioni geneticamente distinte di cellule progenitrici con destini diversi. Una popolazione capace di contribuire all’ endotelio coronarico , è caratterizzata dalla espressione del Sema 3D.
In aggiunta , l’ espressione del Sema 3D delle cellule pro epicardiali contribuisce anche al rivestimento endoteliale del seno venoso. Sebbene , non ancora
direttamente dimostrato è probabile che le semaforine derivate dall’ epicardio funzionano da modello del vascolare coronarico e l’ innervazione durante lo sviluppo. Queste funzioni possono anche contribuire ai segnali epicardiali che modulano la risposta al danno negli adulti.
MODELLO DELLA VENA POLMONARE.
Le vene polmonari hanno il compito di riportare l’ ossigeno al sangue dai polmoni all’ atrio sinistro. Inappropriati modelli delle vene polmonari durante lo sviluppo possono dar luogo a delle connessioni anormali con l’ atrio destro , o con delle strutture venose che connettono l’ atrio destro come il seno coronarico o la vena cava. Questo tipo di connessioni venose polmonari anomale (APVC) possono causare l’ ipossia e sovraccarico del volume del lato destro del cuore , richiedendo
un intervento chirurgico se grave. Anche se si sa però poco circa i segnali di
sviluppo che definiscono le vene polmonari o sulle cause genetiche o ambientali di APVC negli umani , topi Sema 3d-null mostrano APVC e ciò ha fornito nuovi
approfondimenti nello sviluppo fisiopatologico della malformazione delle vene polmonari.
Quando le vene polmonari si formano nel corso della gestazione , Sema 3d è espresso nelle riflessioni mesocardiali adiacenti al plesso vascolare che matura. Si pensa che Sema 3d agisca come una molecola guida repulsiva per costringere a dirigere lo sviluppo delle cellule endoteliali venose polmonari verso l’ atrio sinistro. Tale comportamento è supportato dalla capacità del Sema 3d di respingere cellule endoteliali in vitro, e l’ anormale invasione delle cellule
endoteliali nella regione dove il Sema 3d è normalmente espresso nel Sema 3D nulls. Sema 3d è in grado di legarsi alle cellule dell’ endotelio della nascente vena polmonare , che esprime Nrp1, e Nrp1 è richiesta per la repulsione endoteliale mediata dal Sema 3d , molti studi recenti mostrano che è anche espressa da molte vene e dall’ endotelio linfatico. Mutazioni o variazioni genetiche del Sema 3d possono essere la causa di molti casi di APVC negli umani. In un caso , un
paziente con APVC fu identificato con una variazione molto rara risultante nella sostituzione della fenilalanina con la leucina. La mutazione risulta in una
significante capacità ridotta di legarsi alla Nrp1 e di respingere le cellule endoteliali in vitro.
In futuro , sarebbe interessante investigare sui potenziali contributi delle varianti genetiche nel Sema 3d che segnalano la cascata in APVC.
INNERVAZIONE AUTONOMA DEL CUORE.
I tessuti cardiaci sono innervati dalle fibre nervose simpatiche e parasimpatiche che provocano connessioni critiche per la regolazione del battito cardiaco , la contrattilità , la pressione del sangue in risposta ai cambiamenti nelle esigenze fisiologiche. I nervi simpatici cardiaci , che sono localizzati al di sotto dell’ epicardio, stimolano il battito del cuore , mentre i nervi parasimpatici sono generalmente sub endocardiali e hanno il compito di inibirne il battito .
L’ innervazione simpatica ventricolare è caratterizzata da un gradiente della base all’ apice. I tessuti specializzati nella conduzione come il nodo seno-atriale , il nodo atrio-ventricolare e il fascio di His sono altamente innervati rispetto al miocardio. L’ anormale innervazione può essere associata alle aritmie letali nei cuori malati. Sema 3 a è inizialmente espresso nelle cellule sub endocardiali del miocardio trabeculato dei 2 due ventricoli . Dopo , è limitato alle fibre di Purkinje (
specializzata nella conduzione cellulare) lungo la parete ventricolare. In tutto lo sviluppo embrionale , l’ espressione del Sema 3 a è consistente , con un ruolo rilevante nel modello della innervazione simpatica nel cuore . Sebbene la maggior parte dei topi knockout Sema 3 a muoiono entro una settimana dalla nascita , molti sopravvivono passato lo svezzamento. In questi animali l’ innervazione simpatica cardiaca è priva di pattern e provoca un rallentamento del battito cardiaco. La sovraespressione cardiaca specifica del Sema 3 a riduce significativamente l’ innervazione simpatica suggerendo un ruolo repulsivo e inibitorio del Sema 3 a nel modello e nella crescita neuronale.
Questi animali transgenici Sema 3 a mostrano contrazioni ventricolari premature spontanee e una crescente suscettibilità all’ aritmia ventricolare.
Recentemente , Chen e altri riportano che la sovraespressione del Sema 3 a nelle zone di confine del miocardio circostante un recente infarto miocardiale può
ridurre l’ iperinnervazione che normalmente accompagna le risposte al danno , conseguentemente riduce suscettibilmente la tachicardia ventricolare.
Recentemente, una variazione genetica nel gene Sema 3 a umano fu associata ad un improvviso arresto cardiaco e un’ aritmia ventricolare. Un non sinonimo polimorfismo è stato identificato nel decimo esone del gene Sema 3 a , e questa variazione fu significativamente più comune in una coorte di 83 pazienti
giapponesi diagnosticati con un inspiegabile arresto cardiaco che in 2,958 controlli sani.
Simili ai topi knockout Sema 3 a i pazienti con questa variante I334V hanno
pattern anormali dei nervi simpatici e bradicardia. La variante delle proteine I334V ha ridotto l’ attività in una prova di repulsione.
MODELLO VASCOLARE.
Plexin D1. Le semaforine segnale contribuiscono alla crescita e al modello del sistema vascolare dell’ utero , e la complessità e la ridondanza mediante il quale questi segnali interagiscono l’un l’altro e con altri modelli angiogenetici
nell’ influenzare vasi sanguigni normali e patologici sta diventando apparente. Probabilmente l’ evidenza più drammatica e convincente circa l’ abilità della classe 3 delle semaforine secrete di guidarne la crescita fino alla maturazione endoteliale deriva dal lavoro sul Danio Rerio dove emergenti vasi sanguigni possono essere visualizzati in tempo reale.
Il knockdown del Plxnd1 espresso dalle cellule endoteliali , o dal Sema 3 a secreto dall’ adiacente mesoderma metamerico , produce modelli anormali di vasi con molti sviluppi angiogenici dovuti alla perdita di un segnale guida repellente. Plxnd1 può probabilmente rispondere alle molteplici semaforine di classe 3. Esso può legare il Sema 3 e anche in assenza di un corecettore della neurofilina , e il topo knockout sia del Plxnd1 e del Sema 3 e mostrano difetti intersomitici del midollo vascolare. Sema 3e- Plxnd1 segnale è anche richiesto per il modello pro-pre dorsale dell’ aorta nel giovane embrione. Plxnd1 può reprimere l’ angiogenesi contrastando l’ attività proangiogenetica di VEGF , e Sema 3e-Plxnd1 segnale influendo sul destino cellulare della retina mediante la regolazione della risposta cellulare al VEGF e Notch nelle cellule tip e stalk. Comunque ,Plxnd1 mutante possiede più fenotipi cardiovascolari gravi dei mutanti Sema 3 e , suggerendo che Plxnd1 nelle cellule endoteliali può trasdurre segnali dalle altre semaforine.
A supporto di questa possibilità , PlxnD1 in complesso con Nrp1 e Nrp2 è capace di legare il Sema 3 a , Sema 3c , e Sema 4 a, in vitro.
Plxnd1-deficiente delle cellule endoteliali non riesce a rispondere al Sema 3 a nella camera di BOYDEN e nel test dell’ anello aortico.
LE SEMAFORINE E IL SISTEMA VASCOLARE.
Il comportamento endoteliale può essere modulato da classi multiple delle
semaforine 3. Il segnale Sema 3 a attraverso Nrp1 nelle cellule endoteliali inibisce la proliferazione , la sopravvivenza , la migrazione , l’ adesione e la crescita
capillare nel test del modello aortico e può modulare la neovascolarizzazione retinale dopo un danno come la permeabilità vascolare.
Comunque rimane controverso , che il knockout del Sema 3 a causi lo sviluppo anormale vascolare dei topi. Sema 3b respinge cellule endoteliali legandosi con Nrp1 , quindi funziona come un inibitore angiogenetico. Sema 3c induce la proliferazione delle cellule endoteliali, l’ adesione e la migrazione. Sema 3d inibisce la formazione del tubo endoteliale , l’ adesione e la motilità attraverso modelli Nrp1 e PI3k/ AKT dipendenti. Sema 3f inibisce l’ adesione delle cellule endoteliali alla fibronectina e la loro sopravvivenza Sema 3g agisce come un regolatore positivo dell’ angiogenesi attraverso la stimolazione delle cellule endoteliali e l’ attivazione delle cellule muscolari lisce.
Le semaforine legate alla membrana possiedono tutti e due proprietà pro e anti angiogeniche durante lo sviluppo e in condizioni patologiche. Per esempio , Sema 4 a lega Plxnd1 e inibisce lo sviluppo dell’ angiogenesi , e Sema 4d segnala per mezzo del Plxnb1 le cellule dell’ endotelio al fine di regolare la motilità. Sema 5 a segnale attraverso il recettore Plxnb3 , e i topi privi di Sema 5 a mostrano difetti nel rimodellamento dei vasi sanguigni del cranio .La ramificazione delle vene cardinali del cranio è ridotta nei mutanti Sema 5 a comparato ai controlli. Sema 6A lega i recettori Plxna2 e Plxna4 e regola lo sviluppo vascolare e l’ angiogenesi negli adulti. Una duplice forma del Sema 6 a può inibire l’ angiogenesi e forme spezzate di altre semaforine sono state descritte con funzioni angiogeniche alterate. Il ruolo giocato dai recettori della neurofilina nella vascolarizzazione è complicato dal fatto che possono partecipare direttamente nel Vegf segnale attraverso l’ eterodimerizzazione con Vegfr2 (kdr).
L’ embrione knockout di Nrp1 mostra un ampio range di difetti vascolari, e la sovraespressione di Nrp1 porta alla eccessiva formazione dei vasi sanguigni e dei capillari. Nrp1 è fortemente espresso nella nuova formazione vascolare durante la guarigione delle ferite , e il blocco dell’ Nrp1 segnale riduce la densità vascolare all’ interno della ferita. Nrp2 mancante nei topi è vitale , ma Vegf che induce la neovascolarizzazione della retina è significativamente compromesso nei topi Nrp2 -/-. Entrambi i topi knockout Nrp1 –Nrp2 muoiono presto come E 8.5 e mostrano un più forte fenotipo vascolare rispetto i singoli knockout i quali suggeriscono parziali funzioni ridondanti.
LINFANGIOGENESI E L’ ANGIOGENESI DEL TUMORE.
Semaforine , plexine e neurofiline sono state tutte implicate nell’ angiogenesi dei tumori , un argomento che è stato oggetto di molte valide e recenti recensioni. Le semaforine ligandi espresse dalle cellule tumorali e cellule immuni associate ai tumori possono stimolare pathways pro angiogenetici nelle cellule endoteliali , ed è stata ampiamente esplorata la possibilità dello sviluppo delle terapie
anti-angiogenetiche per il cancro segnalando i suddetti pathways. Sema 3 a e i suoi recettori Nrp1 ,Nrp2 e Plxna1 sono espressi nei vasi linfatici e partecipano sia nella formazione linfatica delle valvole sia nella assemblazione dei vasi linfatici. I topi knockout Nrp2 hanno deboli malformazioni nei vasi linfatici e capillari , ma non difetti delle valvole linfatiche. Sema 3 a , e probabilmente altre semaforine legate alla membrana e secrete , possono partecipare sia al modello linfatico e alla formazione delle valvole. Il modello difettoso linfatico e l’ omeostasi possono risultare nella significante morbilità correlata al linfodema e altre complicazioni , suggerendo che una migliore comprensione del ruolo delle semaforine nella linfogenesi sarà importante nel targeting e nel minimizzare gli effetti collaterali delle potenziali terapie che segnalano i pathways delle semaforine , plexine e neurofiline.
OSSERVAZIONI CONCLUSIVE.
Dalla scoperta delle semaforine come molecole guida degli assoni , per le semaforine segnale è emerso un importante modello in quasi ogni organo e tessuto. Il sistema cardiovascolare non è una eccezione , e un numero
considerevole di dati sottolinea il ruolo critico che le semaforine giocano durante lo sviluppo cardiovascolare e in vari processi di malattia.
Il codice complesso che definisce quali ligandi delle semaforine interagiranno con i recettori al fine di produrre vari risultati sta solo iniziando a emergere , e la
complessità aumenta quando noi consideriamo le combinazioni dei recettori eterodimerici e l’ interazione con i percorsi di segnalazione ad essi legati.
Le anomalie nella semaforina segnale sono componenti che provocano difetti nello sviluppo del patterning e della malattia congenita del cuore.
Cap. 2 IL RECETTORE NEUTROFINA P75 , LE SEMAFORINE E LA
CIRCOLAZIONE NEL CUORE.
I rami simpatici e parasimpatici del Sistema Nervoso Autonomo controllano la funzione cardiaca attraverso l attività coordinata generata dai neuroni all’ interno dei gangli autonomi intercardiaci e del Sistema Nervoso Centrale.
L’attivazione di proiezioni simpatiche efferenti nel cuore aumentano il battito cardiaco, modificando il pattern e la velocità di conduzione dell’impulso nel cuore , aumentando inoltre la contrattilità sia atriale che ventricolare accelerando infine il rilassamento miocardiale.
Nel sistema vascolare il sistema nervoso simpatico ( SNS) riduce la capacità venosa e restringe i vasi di resistenza , aumentando la pressione sanguigna. Al contrario , il sistema nervoso parasimpatico (PSNS) rallenta il battito cardiaco e la velocità di conduzione dell ‘ impulso .
Di recente alcuni fenomeni evidenti hanno portato a credere che PSNS possa anche influire sulla funzione ventricolare , in maniera indiretta contrastando
l’ azione di beta- adrenergico o direttamente mediante l’ inibizione dei canali tipo L Calcio dipendenti. Uno squilibrio transitorio tra questi due rami può provocare un aumento del ritmo cardiaco e della pressione sanguigna quando l’ output del cuore aumenta.
Quando l’attività cardiaca di PSNS persiste contaminando l’ iperattivazione simpatica, come accade in seguito ad un infarto miocardico, questo squilibrio aumenta il rischio che si verifichino eventi cardiaci avversi tra cui : aritmie , ipertensione , ipertrofia cardiaca , e infine insufficienza cardiaca. La suddetta condizione è nota come “ rimodellamento neurale autonomico” e contribuisce ampiamente all’ induzione della fibrillazione ventricolare che quindi aumenta la suscettibilità del paziente fino a condurlo ad una improvvisa morte cardiaca. È plausibile che fattori neutrofici , come le proteine bersaglio secrete dall’ organo essenziali per lo sviluppo e per la differenziazione dei neuroni , siano responsabili
di una notevole neuroplasticità evidente nel SNS degli adulti , incluso il rimodellamento autonomico dopo l’ infarto e all’ inizio e nel progredire
dell’ insufficienza cardiaca congestizia.
Lo sviluppo della formazione di SNS è controllata in maniera intricata da vari fattori di crescita , citochine , molecole di orientamento dell’ assone .
Come sostenevano Sossin e Barker:
“ I primi giorni di vita dei neuroni sono duri. Pochi minuti dopo essere nati ha inizio il processo di estensione nel tentativo di raggiungere le cellule bersaglio appropriate prima che lo facciano i concorrenti. In seguito è necessario integrare spunti trofici e di attività dipendente per poter determinare quale contatto bersaglio è stato ottenuto.”
Tale scenario è valido per i neuroni simpatici .Uno dei regolatori principali della sopravvivenza post-mitotica simpatica del neurone e dell’ innervazione del tessuto bersaglio è il fattore di crescita nervosa ( NGF) .
NGF è prodotto dal cuore e dal sistema vascolare e favorisce la sopravvivenza dei neuroni simpatici , la crescita assonale e la ramificazione . NGF è l’ elemento basilare della famiglia neutrofina (NT) , la quale include il fattore neutrofico cervello derivato (BDNF) , NT3 , e NT4.
È diventato sempre più evidente che NTs svolge un ruolo critico nel controllare le funzioni cardiovascolari come il controllo dei vasi sanguigni , la crescita delle cellule muscolari lisce e lo sviluppo del cuore.
Studi recenti mostrano la capacità del cuore di un embrione di pulcino di secernere fattori neutrofici tra cui NGF , il quale, a sua volta stimola l’ estensione dei neuriti da neuroni sensoriali in vitro .
Negli ultimi tempi è stato notato essere presente nei miociti dei topi appena nati , dove agisce come un fattore di sopravvivenza autocrina. Inoltre, l’ aumento
dell’ espressione di NGF protegge le cellule dall’ apoptosi di ANG2- indotto , e in un modello di infarto miocardico a cui sono soggetti i topi , il trasferimento del gene NGF promuove la sopravvivenza cardiomiocita. In maniera simile, la cancellazione del gene BDNF molto spesso colpisce lo sviluppo del cuore, portando ad una morte prematura nei topi , e i topi che non posseggono il
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recettore di BDNF (TrkB) muoiono non appena nati . Dunque un deficit nella segnalazione di NT può verificarsi nelle malattie cardiache , colpendo non solo la trasmissione simpatica o la ricaptazione della catecolamina nelle aree giunzionali neuroeffetrici , ma può anche incidere sulla vitalità dei cardiomiociti stessi.
La sovraespressione di NGF nel cuore fin dalla nascita porta alla cardiomegalia e all’ ipertrofia patologica . Quindi , NTs può essere richiesto in condizioni ad hoc nelle quali il loro segnale NT è svanito o ostacolato , ma presumibilmente la loro espressione non dovrebbe superare concentrazioni fisiologiche.
Infine , differenti NTs possono provocare effetti differenti.
NT3 mRNA è sotto regolato nel cuore ipertrofico dei topi adulti , e NT3 è probabilmente necessario per contrastare l’ ipertrofia disadattiva. Al contrario, BDNF mRNA è sovraregolato in alta cardiomiopatia salt-induced nei topi , ma va ancora stabilito se questo è un adattamento compensatorio o una caratteristica di peggioramento.
Risposte differenti a NTs sono anche vere in relazione alla crescita dei neuroni simpatici. BDNF prodotto da questi neuroni ( e/o dai loro organi bersaglio) pare agisca attraverso il recettore neutrofico P75 ( P75 NTR), per ostacolare la crescita di NGF- mediato e l’ innervazione del bersaglio .
Quindi, si è teorizzato che il bersaglio di innervazione simpatica è il risultato di un equilibrio finemente coordinato di un comportamento positivo e negativo di NTs presente nello sviluppo e probabilmente nei target maturi. La sopravvivenza e gli effetti di promotore della crescita assonale di NTs sono in primo luogo mediati dall’ attivazione della famiglia TrK dei recettori tirosina chinasi , a ogni modo tutti gli NTs legano anche a P75 NTR, un gruppo della famiglia di recettori TNF. Questo recettore è una molecola pleiotropica segnale ed è capace di indurre un’ ampia varietà di effetti biologici.
Nei neuroni simpatici , P75 NTR forma un complesso di recettori dotati di un’ alta affinità con TRKA , e facilita la crescita e la sopravvivenza di NGF. Inoltre l’ interazione di P75 NRT con TrkA migliora la sua selettività per NGF su NT3 , critica come lo sviluppo simpatico dei neuroni che cambiano dalla loro iniziale dipendenza da NT3 come se crescessero verso i loro bersagli verso NGF una volta raggiunta la loro destinazione. Al contrario, BDNF , prodotto da questi neuroni , favorisce l’ apoptosi attraverso il legame con P75 NRT da solo. Questa
capacità di indurre la morte cellulare è cruciale per stabilire il corretto bilanciamento tra l’ ampiezza della popolazione neuronale e il tessuto innervato. La capacità di BDNF di attivare P 75 NRT pare possa indurre una degenerazione assonale , in maniera selettiva nella fibra esposta a NT. Il soma neuronale e altre fibre sono rimaste intatte nonostante fossero state esposte a NGF . L’ assenza di questi segnali regressivi nei topi P 75 NTR- null si pensa stia alla base dell’ ipernervazione simpatica osservata nell’ occhio e nella ghiandola pineale .
Ad ogni modo , l’ analisi di topi con modelli di innervazione del tessuto in P75 NTR – deficiente è ancora più complicata in base al fatto che il recettore può accoppiarsi anche con la semaforina 3 A (Sema 3 A) recettori neutrofilia -1 , con la plexina A 4 e attenuare la loro abilità di respingere gli assoni in crescita.
Inoltre P 75 NTR interagisce con il complesso recettoriale Nogo, e in tale contesto , in realtà media i segnali repulsivi di crescita attivati da una famiglia di proteine mieline.
Quindi , comprendere il ruolo di P75 NTR nella regolazione simpatica della funzione cardiovascolare è una sfida e un’ impresa complessa che può avere implicazioni nelle malattie cardiache croniche come l’ insufficienza cardiaca. Studi precedenti hanno rivelato un ritardo nello sviluppo dell’ innervazione cardiaca simpatica nei topi P75 NTR -/- , rispetto ai topi Wild- type , ma 11-14 giorni dopo la nascita l’ arborizzazione era più o meno normale nei topi privi di P75 NTR. Comunque , attraverso analisi più attente, Habecker e i suoi colleghi hanno mostrato input assonali simpatici alterati nell’ atrio destro dei topi adulti P75 NTR- null . Essi hanno constatato una crescita della densità simpatica nell’ atrio 4 WK in P75 NTR -/- dopo la nascita, rimpiazzata da una riduzione generale del mantenimento dell’ innervazione nell’ adulto .
Il pattern di arborizzazione era altamente eterogeneo , infatti alcune regioni erano iperinnervate mentre altre erano prive di input simpatici. Al contrario , l’ innervazione parasimpatica era normale in entrambe le fasi nonostante il fatto che i neuroni colinergici del sistema cardiaco intrinseco esprimono anche P75 NTR . Gli animali P75 NTR – null mostrano inoltre un ritmo cardiaco basale ridotto e una risposta allo stress dovuto alla moderazione. Queste risposte alterate risultano in maniera similare dalla perdita della trasmissione simpatica piuttosto che dall’ aumento dell’ attività di PSNS e/o dagli effetti diretti di P75 NTR nelle cellule cardiache.
Infatti, gli altri P75 NTR-null hanno mostrato un contenuto tre volte più alto di norepinefrina (NE) rispetto ai controlli corrispondenti precedenti.
Quindi è plausibile che a causa del rimodellamento simpatico in questi atrii , ad esempio abbassata la densità e la distribuzione alterata delle fibre simpatiche , solo una frazione di NE presente nelle fibre simpatiche P 75 NTR -/- è accessibile per il rilascio , anche quando è applicato uno stimolo di rilascio diretto , come la Tiramina , una forte interazione tra l’ innervazione simpatica e P75 NTR nel cuore è confermata dalla condizione opposta.
L’ induzione dell’ ipernervazione simpatica mediante un’ infusione locale di NGF nel miocardio del cane o nei gangli stellati sinistri è seguita da una immunomarcatura nelle cellule interstiziali e nell’ area periva scolare del miocardio come negli assoni nelle cellule di Schwann , e nelle cellule interstiziali delle fibre simpatiche nervose. Nonostante ciò , il ruolo specifico di P75 NTR nella innervazione simpatica del tessuto bersaglio e le conseguenze funzionali della sua ablazione genetica, non sono ancora ben intese.
Nella seguente pubblicazione a cura del American Journal of phisiology-heart and circulatory phisiology , Lorenz e i suoi collaboratori hanno esposto inoltre il ruolo di P75 NTR nella regolazione dell’ innervazione simpatica del cuore e hanno riportato una drammatica perdita dell’ input delle fibre nel sub endocardio del ventricolo destro (LV) mentre quello relativo al sub epicardio e al ventricolo destro non erano alterati in maniera significativa .
Questo fenotipo notevole ricorda quello osservato nei topi in cui SEMA 3 A è sovraespresso , il quale suggerisce a Lorenz e ai suoi colleghi di considerare la possibilità che l’ interazione di P75 NTR con il sistema SEMA 3 A può spiegare questa perdita selettiva di innervazione .
Al fine di testare questa ipotesi , essi hanno raccolto gangli stellati da topi WT e P75 NTR -/- e hanno dimostrato che i neuroni- nulli erano molto più sensibili alla inibizione di Sema 3 A- mediato della crescita dei neuriti.
Questo risultato suggerisce che i neuroni simpatici innervano il cuore , P75 NTR agisce in maniera tale da smussare gli effetti repulsivi di Sema 3 A , il quale è espresso nel sub endocardio permettendo con ciò l’ arborizzazione assonale in assenza di P 75 NTR e Sema 3 A annulla la crescita degli assoni dal sub endocardio. Mentre sarebbe interessante osservare se la cancellazione di Sema 3
A può compensare la perdita di P 75 NTR , risultati molto più funzionali che hanno differenziato i topi P 75 NTR -/- da quelli WT sono emersi dal presente studio. Quando gli autori hanno esaminato la struttura ventricolare e la sua funzione mediante ecocardiografia ( sotto anestesia) non hanno trovato differenze rilevanti tra i due genotipi in termini di dimensioni LV, accorciamento frazionale, frazione di eiezione e della gittata cardiaca a riposo. Ad ogni modo , essi hanno scoperto una diminuzione della pressione arteriosa media nei topi P75 NTR -/- accompagnata da un calo di pressione sistolica e diastolica . Queste alterazioni sono probabilmente dovute alla espressione periferica ( vascolare) di Sema 3 A , che può abbassare l’ innervazione simpatica e il tono vascolare , determinando una riduzione generale nel postcarico .
La presenza di una riduzione contaminante il post carico ( come suggerito dai presenti dati che mostrano una riduzione media della pressione sistolica e diastolica) , le dimensioni immutate di LV ( dai dati dell’ eco) , e la diminuzione di dP / dt max e dP/ dt min porta a credere nella possibilità che questi topi siano soggetti ad una riduzione media dell’ inotropismo cardiaco , una situazione che ricorda quanto osservato nei beta – bloccanti come il Verapamile .
Comunque studi aggiuntivi valutano direttamente lo stato inotropico autonomo da qualsiasi cambiamento in fase pre e post carico , ad esempio la relazione pressione-volume , confermerebbe in maniera definitiva questa eventualità.
Oltre a questo , sarebbero utili studi che utilizzano miociti , dagli atrii e dai ventricoli ( sia destro che sinistro) , anche se diverse prove a disposizione sembrano escludere la presenza di P 75 NTR nei ventriculociti .
L’ altra scoperta probabilmente più rilevante è la maggiore incidenza di complessi ventricolari prematuri ( PVCs) nei topi P75 NTR -/- , come anche un rallentamento del ritmo cardiaco durante la fase di risveglio di questi animali. Gli autori hanno scoperto che una distribuzione irregolare dei nervi simpatici nei topi P 75 NTR -/- può essere responsabile della generazione di un’ inclinazione dei recettori beta1 – adrenergici attraverso la parete LV.
Nei topi P 75 NTR- null , i recettori beta 1 adrenergici erano considerevolmente più alti nel sub endocardio rispetto al sub epicardio. Dunque , in aggiunta alla naturale anisotropia del tessuto cardiaco , questo cambiamento nel pattern di distribuzione può essere la base per i cambiamenti della contrazione e dello impulso nella propagazione e generazione relative ai topi P75 NTR -/- .
Inoltre il sub endocardio denervato dei topi P 75 NTR –null ha mostrato un notevole picco diastolico aumentando la velocità solo sotto la stimolazione della Dobutamina beta – agonista rispetto ai topi WT .
Per quanto altamente possibile che i topi P75 NTR -/- siano più inclini a sviluppare aritmie ventricolari fatali , bisogna tenere in considerazione che la presenza di battiti ectopici ( ventricolari) va valutata nel contesto in cui essi hanno luogo .
Inoltre la complessità e la frequenza di PVCS , il rischio di uno sviluppo di aritmie fatali e della morte improvvisa , ad esempio in pazienti colpiti da infarto miocardico è legata ad una serie di altri fattori, incluso , tra gli altri , condizioni rientrati , crescita della stimolazione simpatica, ischemia e riperfusione .
Quindi il presente studio apre la strada ad ulteriori e interessanti ricerche in cui i topi P 75 NTR -/- sono soggetti a alterazioni , in seguito monitorate dall ‘ ECG al fine di valutare se essi sono più inclini a questi terribili eventi.
Nel tentativo di dare il via allo scioglimento della complessità di tale meccanismo , evidenziando le alterazioni del ritmo cardiaco, viste nei topi P 75 NTR -/- , gli autori hanno proposto uno scenario intrigante benché non ancora pienamente verificato in relazione a P 75 NTR , NGF , gli enzimi biosintetici che catalizzano la formazione della catecolamina , e infine l’ espressione del recettore beta nel cuore.
La mancanza di P 75 NTR accresce il segnale di NGF – indotto TrKA nei neuroni simpatici , e NGF stimola l’ espressione della tirosina idrossilasi ( TH) , il quale è il passo rate limiting della biosintesi della catecolamina e del rilascio del ganglio verticale superiore . Gli autori dimostrano che il contenuto NE in P 75 NTR -/- LVs non differisce da quello trovato nei topi WT , anche se l’ espressione TH è più forte nell’ LV dei topi P 75 NTR -/- .
Gli autori suggeriscono che nel sub epicardio ha luogo una sintesi maggiore di NE , dovuta a una maggiore attività TH dei neuroni simpatici del subepicardio.
È stato scoperto che livelli di circolazione elevati e locali sono capaci di ridurre la densità del recettore beta , questo può spiegare livelli maggiori di recettori beta 1 nell’ endocardio denervato P 75 NTR -/-il quale mostra una risposta più forte alla Dobutamina.
Questo meccanismo è alla base di possibili aritmogenesi , molti studi infatti hanno suggerito che la stimolazione adrenergica può in seguito , tra le altre cose , portare all’ allungamento della ripolarizzazione , innescando quindi aritmie .
Un ‘ ipotesi lusinghiera è che un’ attivazione crescente degli adrenocettori favorisca la crescita delle correnti in Calcio senza però alterare il reuptake del reticolo sarcoplasmatico , risultante in un elevato calcio diastolico , il quale a sua volta , favorisce oscillazioni del potenziale della membrana e quindi aritmia.
L’ utilizzo dei beta bloccanti aiuterà fortemente a stabilire un maggiore coinvolgimento dei segnali adrenergici alterati nei fenomeni cardiovascolari osservati come conseguenza della cancellazione di P 75 NTR .
Ancora , valutazioni elettrofisiologiche e meccaniche a livello dei miociti , possibilmente isolati da differenti livelli miocardici , dovrebbe definire meglio i processi delle anomalie meccaniche ed elettriche riscontrate nei cuori P75 -/- . Allo stesso tempo sarebbe interessante testare come le alterazioni vascolari e le elettromeccaniche basali beta – stimolate riscontate negli animali P 75 NTR -/- contribuiscono a colpire la capacità di questi animali di far fronte ad un carico di lavoro , come durante esercizi sostenuti.
Come avviene negli studi più interessanti , queste scoperte fanno crescere il numero di questioni relative alle molecole e hai segnali. Ad esempio , è la risposta alterata di SEMA 3 A ad essere responsabile della perdita dell’ innervazione sub endocardiale? Attraverso quali altri meccanismi P 75 NTR regola l’ input cardiaco simpatico , ad esempio , nell’ atrio destro?
Dopo tutto i lati destro e sinistro del cuore sembrano accusare la scomparsa di P 75 in maniera diversa ( da notare l’ alto contenuto di NE in presenza di condizioni normali di densità delle innervazioni simpatiche nel ventricolo destro ) .
Questi quesiti , combinati a quelli avanzati nella discussione precedente , evidenziano ancora una volta la rilevanza del rimodellamento autonomico , simpatico nella comparsa e nello sviluppo di disordini cardiaci acuti e cronici come l’ infarto miocardico , l’ improvvisa morte cardiaca , diabete , ipertensione , e infine l’ insufficienza cardiaca congestizia.
Uno dei percorsi più stimolanti per le future ricerche sarà stabilire se i pazienti affetti da vari disturbi cardiovascolari presentano polimorfismi di P 75 NTR correlati a tali condizioni.
È certo però che mancanze di P 75 NTR , eccessi di semaforine , e la segnalazione ad esse associata , può ricondurre al traffico simpatico interno al cuore , ma deve essere tuttavia formalmente stabilito se e come questa deviazione possa provocare la congestione vascolare e infortuni cardiaci.
Cap. 3 LA SEMAFORINA 4 A ESERCITA UN EFFETTO
PROANGIOGENICO ACCRESCENDO L’ ESPRESSIONE DEL FATTORE
A DI CRESCITA VASCOLARE ENDOTELIALE.
Le semaforine segnale guida degli assoni e i loro recettori plexina pare siano capaci di regolare l’ angiogenesi sia fisiologica che patologica.
Sema 4 A gioca un ruolo importante all’ interno del sistema immunitario , inducendo l’ attivazione delle cellule T , ma ad oggi , il ruolo di Sema4 A nella regolazione della funzione dei macrofagi durante i processi infiammatori e angiogenici rimane nebulosa. In questo studio noi mostriamo come l’ attivazione dei macrofagi da parte di LPS ligando TLR e dell’ acido polinosinico-policitidilico porta ad una crescita tempo dipendente di Sema 4 A e dei suoi recettori : plexina B2 e plexina D1.
Inoltre , in un modello di topo affetto da peritonite indotta dal tioglicollato, è stato rintracciato Sema 4 A nei monociti infiammatori LY6C high e nei macrofagi peritoneali. Attivando la sua azione mediante plexina D1 , Sema 4 A esogeno stimola fortemente lo spostamento dei macrofagi.
Da notare che plexina D1 attivato da Sema 4 A ha aumentato l’ espressione del fattore-A di crescita vascolare endoteliale , ma non quello delle chemochine infiammatorie. I macrofagi stimolati da Sema 4 A sono capaci di attivare il recettore-2 del fattore di crescita vascolare endoteliale e i percorsi PI3K/serina / treonina chinasi AkT nelle cellule endoteliali e sostiene la loro migrazione nella angiogenesi in vivo. Notevolmente , nel modello di topo in vivo colpito da
riperfusione/ ischemia cardiaca , Sema 4 A era espresso in maniera elevata nei macrofagi implicati nell’ area danneggiata .
Possiamo dunque concludere che Sema4 A attiva un programma genetico ristretto e specializzato in relazione ai macrofagi capace di sostenere l’ angiogenesi e partecipa al loro reclutamento e attivazione nei danni infiammatori.
Le semaforine sono un’ ampia famiglia di proteine extracellulari presenti dai virus ai primati e si dividono in otto classi . Le classi 1,4,5,6 e 7 sono legate alla
membrana , mentre le classi 2,3 e V sono secrete , anche se alcune Sema associate alla membrana diventano solubili dopo uno sfaldamento proteolitico. Originariamente scoperte come molecole sterzo per lo sviluppo degli assoni , è stato in seguito mostrato come queste fossero coinvolte nella funzione neuronale , nel patterning vascolare , nello sviluppo del cuore e nella risposta immunitaria. Gli effetti biologici delle Sema contrastano le plexine le quali , da sole o associate ad altri corecettori dotati di funzioni modulatorie , fanno da segnale all’ interno delle cellule. Ad ogni modo , le Sema più secrete , incluse Sema 3 A e Sema 3 F , non si legano direttamente alle plexine e utilizzano le neurofiline come sottounità di corecettori legati ai ligandi. Come riportato nella navigazione degli assoni , le Sema possono essere sia chemiorepellenti che chemioattrattive in relazione alle cellule endoteliali ( ECs) . la classe 3 delle semaforine è stata anche implicata in modelli sperimentali di angiogenesi tumorale. Ad esempio , Sema 3E regola la crescita del cancro , la diffusione e l’ angiogenesi tumorale.
Inoltre , recenti studi indicano che Sema 3 A è un inibitore endogeno angiogenico che regola l’ interruzione angiogenica , inibisce la crescita tumorale , normalizza il sistema vascolare del tumore e ne riduce l’ ipossia. Oltre alle semaforine classe 3 , anche quelle classe 4 regolano l’ angiogenesi, sia in vitro che in vivo , Sema 4D promuove l’ angiogenesi attraverso la plexina B1 .
Recentemente queste osservazioni sono state estese all’ angiogenesi tumorale , e viene indicato che i macrofagi reclutati nei tumori sono la fonte maggiore di Sema 4D.
Un’ altra classe di semaforine legate alla membrana chiamate Sema 4 A ,
aumentano progressivamente la loro espressione nello sviluppo degli embrioni di topo e diventano prominenti nel cervello , nel polmone , nel rene , nella milza , nel testicolo e nella ghiandola mammaria degli adulti .
In contrapposizione a Sema 4 D, nel momento in cui si lega alla plexina D1 Sema 4 A inibisce lo spostamento di EC e nell’ angiogenesi in vivo sopprime
!
l’ adesione delle cellule integrina dipendenti. Inoltre , in presenza della famiglia Rho GTPase Rnd1 , il legarsi di Sema 4 A alla plexina B1 –B2 e B3 induce la contrazione della cellula COS7 attraverso l’ attività enzimatica della proteina R-RAS GTPase attivante , che caratterizza tutti i citodomini della plexina studiati finora . Oltre a fungere da segnale chemiorepulsivo attraverso le plexine di tipo B è stato dimostrato che Sema 4 A è espresso nelle cellule dendritiche , dove stimola l’ attivazione della cellula T attraverso il recettore Tim-2 , un membro della cellula T Ig e delle proteine dominio mucina espresse nelle cellule T attivate. Inoltre le cellule T hanno bisogno di Sema 4 A per permettere la differenziazione dalle cellule Th. I topi Sema 4 A –deficienti presentano delle risposte Th1 difettose , indicanti che l’ induzione di Sema 4 A nelle cellule Th1 è necessaria per la loro differenziazione , o tramite l’ interazione di cellule affini con le cellule Th1 , oppure seguendo un percorso autocrino.
Recentemente è stato mostrato che Sema 4 A è upregolato da allergeni o VEGF nelle cellule bronchiali epiteliali , esprimendo la plexina D1 e la plexina B1 , puntando quindi su Sema 4 A come un elemento importante nei disturbi infiammatori allergici aerei.
Questo dato evidenzia il ruolo importante giocato da Sema 4 A nella regolazione dell’ angiogenesi e nel funzionamento del sistema immunitario , anche se , il suo specifico coinvolgimento nella risposta angiogenica e infiammatoria nei macrofagi , è ancora poco compreso.
In questo studio abbiamo analizzato l’ espressione e la funzione di Sema 4 A nei macrofagi di modelli sperimentali in vitro e in vivo , incluso test angiogenici della membrana carioallantoidea dei polli (CAM) , peritoniti-tioglicollate-indotte , e modelli di danni provocati da ischemia / riperfusione cardiaca (I /R) , caratterizzati dalla crescita dell’ angiogenesi , dal rimodellamento del tessuto e dal reclutamento delle cellule infiammatorie . In questo studio noi identifichiamo una nuova funzione di Sema 4 A come modulatore delle funzioni dei macrofagi nei processi
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MATERIALI E METODI ( cultura delle cellule).
I monociti umani sono stati isolati dai leucociti di donatori sani ottenuti dal centro di trasfusione AVIS ( Torino , Italia) .
Il sangue è stato lavato una volta con PBS 1X a 400x g per rimuovere il plasma e le piastrine e poi centrifugato a 600xg per 30 minuti a temperatura ambiente in un gradiente Ficoll.
Le cellule sono state raccolte nell’ interfaccia , lavate due volte con PBS 1X , e i monociti sono stati isolati in un gradiente percoll a 700x9 per 30 minuti a
temperatura ambiente.
Le cellule nell’ interfaccia sono state raccolte , lavate due volte con PBS 1X , e placcate ad una densità di 1.5x 105 cellule/cm2 in RPMI 1640 .
I monociti sono stati lasciati a riposo per un’ ora e in seguito il mezzo è stato sostituito da RPMI 1640 integrato con 10% FCS . HUVECs erano isolati dalle vene del cordone ombelicale , caratterizzati , e cresciuti in M199 , contenenti 20 % FCS , estratto di cervello bovino , eparina (50 microgrammi/ml) e
penicillina-streptomicina (200 U/ml ) su dischi piatti di tessuti raccolti coperti di gelatina.
LE CONDIZIONI DI COLTURA DEI MACROFAGI NELLE CELLULE
UMANE.
Per ottenere diversi macrofagi , i monociti umani sono stati raccolti per 7dì RPMI 1640 dai globuli bianchi e integrati con 10% FCS e 100 mg/ml M-CSF a livelli di ossigeno normossici (21% O2) in una incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi. Per gli esperimenti ipossici , i macrofagi differenziati sono stati incubati per altre 18 ore in una atmosfera di 1% di ossigeno.
I macrofagi differenziati a distanza di una settimana sono stati polarizzati mediante la sostituzione del mezzo tramite per altre 18 ore con RPMI 1640 integrato con 5% FCS.
Per ottenere la polarizzazione 100 ng/ml LPS con 20 ng/ml IFN-gamma (M1 polarizzazione) o 20 ng/ml IL-4 (M2 polarizzazione) è stato aggiunto all’ elemento per 18 ore. I macrofagi differenziati erano esposti a PAM3 Cys ( 2microgrammi/ml ) a acido polinosinico –policitidilico (poly I:C , 10 microgrammi/ ml) , flagellina
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( 5microgrammi/ml ) R848 (3microgrammi/ml ) e CpG ODN 2006 (1microgrammo/ml) per 18 ore.
ANALISI RT-PCR IN TEMPO REALE.
Le analisi RT-PCR sono state svolte come descritto in precedenza.
cDNA provenienti dai tessuti I/R e dai macrofagi Sema 4 A –trattati , sono stati analizzati dalla matrice a bassa densità TaqMam basata sulla carta microfluidica applicata ai biosistemi (applied biosystems) contenente 48 sonde per i tessuti I/R e 96 sonde per i macrofagi.
cDNA delle cellule è stato analizzato mediante RT-PCR in tempo reale ed eseguito in triplice copia utilizzando un mix di test d’ espressione genetica
( Applied-Biosystems) e i risultati sono stati analizzati da un programma gestionale SDS e RQ al fine di ottenere una quantificazione relativa basata sull’ equazione aritmetica 2 (alla meno ∆∆ct) , nella quale ∆∆ct è il livello del segnale normalizzato in un campione relativo in corrispondenza al campione calibratore.
mRNA proveniente dai tessuti I/R era normalizzato dal gene 18S dominante , mentre il gene GAPDH era utilizzato per normalizzare mRNA dei macrofagi umani . La quantificazione relativa normalizzata (RQ) delle modifiche apportate è stata calcolata in comparazione con ∆ct di topi non trattati o cellule controllo.
ANALISI WESTERN-BLOT.
Le analisi western-blot sono state svolte come descritto precendentemente. Brevemente, i macrofagi umani ,HUVECs e le proteine delle cellule peritoneali dei topi sono state estratte con un tampone di lisi ( 50 mmol tris- Hcl , 150 mmol NaCl ,5 mmol/l Na3Vo , 1 mmol/I PMSF, 0.01 mmol/l cloruro di zinco , inibitori proteasi , e 1% Triton X-100).
Le proteine sono state quantificate utilizzando il test BCA (Thermo scientific) . Quantità equivalenti di proteine ( 50microgrammi) sono state sciolte da SDS-PAGE in un gel poliacrilammide a 12% o 8% trasferite nelle membrane di nitrocellulosa ( Amersham Biosciences) .
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Dopo aver bloccato con BSA TBS/3% o latte scremato al 5% , le membrane sono state incubate con anti-VEGF , e anti- Sema 4 A, anti-SEMA 3E , recettore VEGF(VEGFR-2) , POSPHO-VEGFR2 , PHOSPHO-AKT , ANTI-PHOSPHO-ERK , ANTI-AKT , ANTI-ERK ( Cell signaling tecnology) Abs primario a 4 gradi centigradi notturni.
Le membrane sono state incubate con HRP-coniugato secondario Abs , e le proteine immunoreattive sono state visualizzate dal sistema ECL (GE HEALT CARE) .
L’ intensità del segnale è stata SEMA quantificata da strumenti del programma chemiodoc Bio-Rad , e i conseguenti dati sono utilizzati come indici della densitometria di Sema 4A beta- actina o beta- tubulina.
ELISA.
ELISA è stato eseguito come descritto precedentemente.
I macrofagi surnatanti sono stati raccolti e concentrati medianti l’ utilizzo di
dispositivi filtranti centrifughi ( centricon YM-10 millipore) , mentre le proteine ( dei macrofagi) sono state estratte utilizzando un tampone di lisi.
Per individuare Sema 4 A , il suo rivestimento ha avuto luogo mediante l’ utilizzo di proteine lisate 2microgrammi/ ml o 50 microlitri di surnatanti distribuiti all’ interno di alcune micro piastre di polistirene. Il disco include i duplicati di ciascun
campione.
Dopo l’ incubazione notturna a 4 gradi, i dischi sono stati lavati una volta con PBS e bloccati con BSA 3% in PBS 1x per un’ ora a 37 gradi. Inizialmente Ab anti-Sema (Peprotech) è stato diluito 1:200 in BSA 3% in PBS 1x e aggiunto al disco. Dopo l’ incubazione a 37 gradi per due ore , i dischi sono stati sciacquati 3 volte e sono stati diluiti 1:2000 in una soluzione ( di lavaggio).
Il disco è stato incubato a 37 gradi e nuovamente risciacquato. Il substrato per ossidasi 1-step turbo TMB-ELISA è stato aggiunto e incubato a temperatura ambiente e al buio.
La reazione è stata bloccata aggiungendo acido solforico. L’ OD è stato misurato ad una lunghezza d’ onda di 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre synergy HT automatico .
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Per l’ individuazione di VEGF-A , i surnatanti provenienti dai macrofagi trattati o no con Sema 4 A ricombinante umano ( 10 e 100 mmol/l) sono stati raccolti per 18 ore , concentrati e caricati su una piastra per la determinazione del livello VEGF-A. Al fine di generare una curva standard , abbiamo misurato l’ assorbanza della crescente concentrazione relativa al ricombinante Sema 4 A o VEGF-A.
TEST DI MIGRAZIONE.
La migrazione dei macrofagi è stata misurata con una camera boyden chemio taxis 48-well utilizzando membrane filtro polivinilpirrolidone con un poro di diametro 5 micrometri.
Nel momento in cui ha avuto luogo l’ esposizione a LPS (100 ng/ml) e
IFN-gamma (20 ng/ml) per 18 ore , i macrofagi umani sono stati raccolti con accutase. , risospesi in RPMI 1640 integrato con 1% FCS solo o integrato con 50 mmol/l Sema 4 A ricombinate umano o Sema 3E.
Dopo l’ incubazione a 37 gradi durata 4 ore , il lato superiore dell’ inserto della membrana inserita è stato ripulito dalle cellule , e il lato inferiore è stato fissato con metanolo e macchiato con ematossilina ed eosina.
Le cellule che si sono spostate verso la parte inferiore della membrana sono state conteggiate mediante un microscopio Olympus BX60F-3 utilizzando un
ingrandimento originale.
Per il test di migrazione ECs , le cellule risospese nel mezzo M199 , sono state seminate nella superficie superiore di una membrana filtro di polivinilpirrolidone , con un’ ampiezza di diametro pari a 8 micrometri , rivestita con 50 microgrammi/ml di fibronectina o con 0.1 % di gelatina .
Le fonti deboli della camera sono state alimentate con il mezzo M199 ( da solo) o integrate con 10 o 50 nmol/ml di Sema 4 A ricombinante umano in presenza o no di VEGF-A umano (30 ng/ml).
Per il test di migrazione di EC e della cocultura dei macrofagi , è stato incubato un monostrato di macrofagi per 18 ore con Sema 4 A ( 10/100 nmol/l) con o senza Bevacizumab ( 1 microgrammo/ml) , anti-IL-8 (1 microgrammo/ml) , anti-plexina D1 ( 20 microgrammi/ml) , bloccando ABS o IgG 1 o il controllo ABS IgG2A ( 1 e 20 microgrammi/ml).
