I linfociti e le piastrine sono le cellule principali che esprimono Sema 4D nel sistema ematopoietico. Abbiamo ipotizzato che l’ aumento dei livelli di Sema 4D nel plasma dei pazienti HF può essere dovuto all’ aumento dell’ espressione o dello shedding nei linfociti circolanti o nelle piastrine.
È interessante notare che , nonostante il numero dei linfociti in generale non fosse alterato, la percentuale di cellule –T Sema 4D high CD3+ era più alto nei pazienti HF rispetto a quelli sani (P= 0.002). Questa differenza non è stata osservata nelle cellule CD19+ B (P= 0.46) in questi due gruppi. Questi risultati indicano che i linfociti-T Sema 4D positivi erano aumentati nei pazienti HF , che può favorire l’ aumento dei livelli di Sema 4D nel plasma di questi pazienti. Abbiamo anche esaminato la sottopopolazione e abbiamo scoperto che
cd
l’ espressione di Sema 4D nelle cellule-T sia Sema 4d high CD4+ (P 0.0006) sia Sema 4D high erano notevolmente più alti nei pazienti HF rispetto a quelli sani. Per valutare se le piastrine Sema 4D contribuiscono all’ aumento dei livelli di Sema 4D nei pazienti HF , abbiamo isolato le piastrine nei pazienti HF e in quelli sani e abbiamo misurato l’ espressione di Sema 4D. Le piastrine sono state doppiamente macchiate con anticorpi anti- CD41 e anti-Sema 4D. I pazienti HF hanno avuto un leggero aumento dei livelli delle piastrine di Sema 4D high solubile rispetto agli individui sani. La differenza , comunque , non è statisticamente
rilevante ( P= 0.188).
ef
DISCUSSIONE.
L’ attivazione dei linfociti e delle piastrine aumenta l’ espressione di Sema 4D e il conseguente sfaldamento proteolitico per generare forme solubili di Sema 4D. I livelli di Sema 4D nel plasma possono variare in caso di condizioni patologiche. Diversi studi hanno utilizzato Elisa per misurare Sema 4D nel siero umano e dei topi o nella cultura delle cellule.
Ad ogni modo , le misurazioni fatte su campioni di siero sono potenzialmente confuse dal rilascio di Sema 4D dalle piastrine ex vivo durante la preparazione del siero dagli interi campioni di sangue , rendendo complicato l’ utilizzo dei dati necessari a capire i livelli di Sema 4D nel plasma.
Qui abbiamo focalizzato sui livelli di Sema 4D nel plasma , i quali possono riflettere meglio i livelli di Sema 4D solubile circolante nel sangue.
Abbiamo sviluppato un Elisa utilizzando due anticorpi contro diversi epitopi nel dominio extracellulare di Sema 4D e individuato Sema 4D nel plasma umano. Inaspettatamente , abbiamo riscontrato che i livelli erano più bassi nelle donne sane rispetto ai maschi , suggerendo che gli ormoni sessuali possano influenzare l’ espressione o lo shedding di Sema 4D. Infatti 17- beta estradiolo , un potente estrogeno , ha inibito l’ espressione di Sema 4D nelle cellule Jurkat T-derivate e lo shedding di Sema 4D collagene-indotto nelle piastrine umane.
Possibilmente , l’ estrogeno e i suoi derivati possono inibire l’ espressione di Sema 4D e lo shedding in vivo , avendo come risultato una piccola differenza di genere osservata nei soggetti sani.
Un’ importante scoperta fatta in questo studio è che i livelli di Sema 4D nel plasma erano molto più alti nei pazienti HF rispetto ai pazienti sani.
A differenza dei controlli sui soggetti sani , non abbiamo osservato una forte differenza di genere relativa ai livelli di Sema 4D nel plasma nei pazienti HF. Nel momento in cui i livelli di Sema 4D nel plasma erano significativamente elevati nei pazienti HF , sia maschi che femmine , il loro aumento può avere oscurato la differenza che ha luogo negli adulti sani. In alternativa , l’ effetto
inibitorio degli ormoni femminili sull’ espressione o sullo shedding di Sema 4D può essere controbilanciato da altri cambi neurali ormonali che possono verificarsi nei pazienti HF.
gh
Per capire il meccanismo che sta alla base dei livelli elevati di Sema 4D nel plasma dei pazienti HF , abbiamo analizzato le piastrine e le cellule T , le due maggiori risorse cellulari di Sema 4D nel sangue. Dal flusso citometrico , non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di Sema 4 A nelle piastrine tra i pazienti HF e quelli sani , suggerendo che altre cellule del sangue , per lo più le cellule T , siano la prima fonte di crescita dei livelli di Sema 4D nel plasma dei pazienti HF. Infatti abbiamo scoperto che i pazienti HF sono soggetti ad un
notevole aumento della sottopopolazione delle cellule T che era Sema 4D positivo, il quale includeva le cellule Sema 4D high CD3+ , Sema 4D high CD4+ , Sema 4 high CD8+ .
Dall’ altro lato non abbiamo rilevato ulteriori differenze nella popolazione delle cellule CD19+B tra i pazienti HF e quelli sani. Questi risultati indicano che la
sottopopolazione delle cellule T Sema 4D positive era aumentata nei pazienti HF e può contribuire alla presenza di alti livelli di Sema 4D nel plasma dei pazienti. Un ulteriore ricerca sulla relazione delle cellule T di Sema 4D high con marcatori di infiammazione e con i livelli di citochine nell’ insufficienza cardiaca aiuterebbe a capire il meccanismo di questo disordine vascolare. Sema 4D è una proteina integrale della membrana.
La metalloproteinasi ADAM17 e MT1-MMP pare sia capace di diffondere Sema 4 A dalla superficie delle piastrine e delle cellule cancerogene. MT1-MMP è
espresso nelle cellule T. Nelle piastrine , ADAM17 è il principale enzima responsabile della diffusione di Sema 4D , come indicato dalla mancanza di distribuzione di Sema 4D in assenza di ADAM17.
Alcuni studi hanno mostrato che l’ espressione di ADAM17 e MT-MMP1 è up regolata nei cardiomiociti e nei PBMC dei pazienti con problemi di cuore . È possibile che l’ aumento dell’ attività di ADAM17 e MT1-MMP favorisca la
diffusione di Sema 4D dalle cellule T dei pazienti HF , contribuendo all’ aumento dei livelli di Sema 4D nel plasma .
Un’ altra notevole scoperta fatta in questo studio è che i livelli di Sema 4D nel plasma dei pazienti HF con diabete erano anche più alti rispetto a quelli HF che non soffrivano di diabete. Il diabete è un disturbo metabolico cronico progressivo. Due recettori Sema 4D , la plexina B1 e B2 , sono stati identificati nei condotti pancreatici epiteliali degli embrioni di topo. La loro espressione pare colocalizzarsi con le cellule B che producono insulina e con quelle che producono glucagone.
ij
Scoperte simili sono state riscontrate nel pancreas umano , dove i linfociti Sema 4D-infiltrati interagiscono con le cellule tumorali plexina B1-positive nei condotti pancreatici . è possibile che nei pazienti HF una crescente sottopopolazione di cellule T Sema 4D positive può colpire le cellule pancreatiche e ridurre la produzione di insulina.
In aggiunta Sema 4D , può esacerbare le complicazioni vascolari nei pazienti DM interagendo con le cellule endoteliali , promuovendo l’ infiammazione vascolare , la disfunzione endoteliale , la formazione di microtrombi e l’ aterosclerosi.
Tirando le somme , noi affermiamo nel presente studio che Sema 4D è presente nel plasma degli individui sani e che il suo livello aumenta nei pazienti HF , specialmente in quelli anche diabetici. L’ aumento dei livelli di Sema 4D nel plasma era associato ad un aumento delle cellule T nei pazienti HF.
Questi risultati suggeriscono un possibile meccanismo attraverso il quale Sema 4D solubile nel plasma e le cellule T Sema 4D positive posso contribuire allo sviluppo e alla progressione dell’ insufficienza cardiaca e del diabete nei pazienti. Il nostro studio ha però i suoi limiti a causa della sua natura retrospettiva e del numero relativamente piccolo di campioni di pazienti. Dall’ altro lato , HF e il diabete possono risultare in alti livelli di Sema 4D nel plasma , che a loro volta possono esacerbare HF e il diabete.
Le nostre scoperte dovrebbero incoraggiare studi futuri sui modelli di animali con un gruppo più ampio di pazienti per capire il ruolo di Sema 4D nell’ insufficienza cardiaca e nel diabete.
kl