Biologia Molecolare

Isolamento dell’RNA e retrotrascrizione del DNA complementare (cDNA):

I campioni sottoposti a macrodissezione manuale sono stati successivamente deparaffinati mediante due immersioni in xilolo e lavaggi in una scala di alcool a concentrazioni decrescenti (da 99% a 50%); successivamente è stato estratto l’RNA totale utilizzando il kit RNAeasy FFPE (Qiagen), secondo le istruzioni riportate sull’apposito protocollo (RNeasy® FFPE Handbook ).

500 nanogrammi di RNA totale sono stati utilizzati per la sintesi del cDNA in un volume di reazione di 20 µl , usando il Kit“RevertAid First Strand cDNA” (Fermentas).

RT-PCR, polymerasy-chain-reaction real-time:

La RT-PCR è una reazione semiquantitativa che ci ha permesso la quantificazione dell’mRNA di CXCL10, CXCL1, CCL2. La real time RT-PCR è stata effettuata mediante l’utilizzo del kit Rotor Gene Sybr Green PCR (Qiagen) nello strumento Rotor Gene 6000 (Qiagen).

Sono stati scelti i Primer Quanti Tect Assay (Qiagen) specifici per CXCL10 (NM_001565) , CXCL1 (NM_001511), CCL2 (NM_002982) e per la beta-Actina (NM_001101).

La beta-Actina è stata scelta come gene di riferimento (gene housekeeping), in quanto espressa costitutivamante da tutte le cellule umane sia normali che patologiche.

Il metodo comparativo del “threshold cycle”,( calcolo del ciclo soglia (Ct)), definito come 2-∆∆Ct è stato usato per calcolare il fold di espressione per ogni gene.

Ogni esperimento è stato valutato con tre PCR e i dati sono stati presentati dopo valutazione statistica, comparata anche ai risultati immunoistochimici.

7.2.4 Analisi statistica

Le indagini statistiche sono state condotte con il programma STATISTICA 6.1 Statsoft utilizzando il t-test di Student, il test del Chi quadro e il test di Mann-Whitney . La significatività viene definita come p < 0,05.

8. Risultati

8.1 Caratteri anatomo-clinici dei 101 carcinomi papillari e 38

carcinomi anaplastici analizzati

I dati anatomo-clinici relativi ai 101 carcinomi papillari studiati sono distribuiti secondo quanto descritto in Tabella 3.

Sesso M=26 (26%) F=75 (74%) Media Mediana Età 48,6 47 Dimensione (cm) 1,83 1,6 N° casi % Istotipo FVPTC 39 39 CVPTC 46 46 TCVPTC 16 16 Infiltrazione capsula tumorale 73 72 Infiltrazione capsula tiroidea 39 39 Multifocalità 42 42 Bilateralità 33 33 Presenza di metastasi linfonodali 20 20 BRAF wt 57 56% BRAF mutato 44 44% Tabella 3

L’età media dei pazienti è risultata 48,6 anni, con un range compreso tra 12 e 78 anni, con mediana di 47 (SD +/-15); 75 (74%) pazienti sono di sesso femminile, 26 (26%) di sesso maschile.

La dimensione media dei tumori è 1,83 cm (range 0,5 e 5,2 cm), con mediana pari a 1,6 cm (SD +/-0,8). Nell’ambito dei 100 carcinomi papillari abbiamo osservato: 46 (46%) casi di carcinoma papillare variante classica (CVPTC), 39 (39%) casi di carcinoma papillare variante follicolare (FVPTC) e 16 (16%) casi di carcinoma papillare variante a cellule alte (TCVPTC).

I dati anatomo-clinici relativi ai 38 carcinomi anaplastici studiati sono distribuiti secondo quanto descritto in Tabella 4.

Sesso M=20 (50%) F=20 (50%) Media Mediana Età 65 65 Dimensione (cm) 6,9 7 N° casi % Infiltrazione capsula tumorale 7 19 Infiltrazione capsula tiroidea 29 81 Multifocalità 15 47 Bilateralità 15 47 Presenza di metastasi linfonodali 13 33 BRAF wt 34 90% BRAF mutato 4 10% Tabella 4

L’età media dei pazienti è risultata 65 anni, con mediana di 65 (SD +/-3,7); 20 (50%) pazienti sono di sesso femminile, 20 (50%) di sesso maschile.

La dimensione media dei tumori è 6,9 cm (range 2 e 16 cm), con mediana pari a 7 (SD +/-11). L’81% di queste neoplasia ha un’estensione extratiroidea alla diagnosi; nel 47% dei casi sono tumori multifocali e bilaterali. Infine metastasi linfonodali sono presenti nel 33% dei casi.

L’età media dei 21 casi di controllo è di 47 anni, range compreso tra 28 e 78 anni, con mediana di 46 (SD +/-16); 15 pazienti sono di sesso femminile e 6 di sesso maschile.

Nello studio è stato anche ricercata la presenza di riarrangiamenti RET/PTC; tuttavia dato che nessuno dei casi analizzati è risulato mutato, tale parametro è stato escluso dalla successiva analisi statistica.

8.2 La tiroidite

La presenza di infiltrato linfocitario è stato osservato in ciascuno dei 101 casi di carcinoma papillare e nei 38 casi di carcinoma anaplastico. I carcinomi indifferenziati sono tutti negativi alla valutazione dell’infiltrato linfocitario. Viceversa 32 casi di carcinoma papillare (32%) presentano tiroidite. In particolare, l’infiltrato linfocitario intratumorale è risultato presente in 35 casi (35%) su 101. L'infiltrato peritumorale nella regione della capsula o del vallo di infiltrazione tumorale, è presente nel 54% dei casi (n=54), mentre è minore la presenza di infiltrato linfocitario extratumorale osservato solo in 23 casi (23%).

La tiroidite intratumorale è proporzionale alla presenza di capsula tumorale (p=0,0005), viceversa è inversamente proporzionale all’infiltrazione della capsula tiroidea (p=0,002). Inoltre è significativamente correlata al minor grado di differenziazione istologica (p=0,0002) e all’istotipo (p=0,0087), in particolare è più marcata nella variante classica e a cellule alte, rispetto alla variante follicolare. Non sono state riscontrate correlazioni con l’età alla diagnosi, il sesso, la dimensione, la multifocalità, la bilateralità e la presenza di metastasi e linfonodali. Infine non è stata osservata alcune correlazione con la presenza di mast cell triptasi positive.

La presenza di infiltrato linfocitario intratumorale correla in modo significativo (p=0,010) con presenza di macrofagi CD68 positivi; non risulta invece esserci una valida associazione con mastcells triptasi positive e con l’espressione di chemochine.

E’ stata infine riscontrata una diretta correlazione tra la presenza di tiroidite linfocitaria intratumorale e le mutazioni di BRAF (p=0,0139).

L’infiltrato linfocitario peritumorale è direttamente proporzionale all’invasione della capsula tiroidea (p=0,04) e ad un istotipo più aggressivo (p=0,0015), essendo più abbondate nelle variati a cellule alte rispetto alla variante classica e follicolare.

La presenza dell’infiltrato linfocitario peritumorale è invece indipendente dagli altri parametri anatomoclinico, quali età, sesso, multifocalità, bilateralità e presenza di metastasi linfonodali e dall’espressione di chemochine.

Anche in questo caso si è osservata una correlazione con la presenza di macrofagi CD68 positivi (p=0,002) e con le mutazioni di BRAF (p=0,035).

Ancora una volta l’infiltrato linfocitario extratumorale è significativamente correlato all’istotipo meno differenziato (p=0,0031), mentre risulta indipendente dall’età e dal sesso dei pazienti, dalla multifocalità, dalla bilateralità, dalla presenza di metastasi linfonodali e di infiltrazione della capsula tiroidea e dall’espressione di chemochine.

La tiroidite extratumorale correla significativamente (p=0,031) con la presenza di macrofagi CD68 positivi ma non con quella di mastcells triptasi positive.

Infine si conferma la presenza di una relazione (p=0,032) tra l’infiltrato linfocitario e la mutazione di BRAF.

Nei 21 casi controllo di tiroide normale, la tiroidite linfocitaria risulta virtualmente assente.

A: tiroidite con centri germinativi; B,C:tiroidite intratumorale

8.3 Immunoistochimica

Tramite immunoreattività è stata osservata la distribuzione dei vari cloni cellulari e sono state ricercate le correlazioni statistiche esistenti tra questi e la loro localizzazione nel contesto dell’infiltrato infiammatorio relativo al tumore, da distinguersi in intratumorale, a livello del vallo e della capsula tumorale. Come precedentemente

riportato la ricerca dei macrofagi e dei mastociti è stata effettuata solo sui campioni di carcinoma papillare, escludendo dall’analisi i carcinomi anaplastici e i tessuti tiroidei normali.

Inoltre è stata ricercata l’espressione di chemochine nelle cellule tumorali sia dei carcinomi differenziati che indifferenziati e confrontata con l’espressione delle stesse nel parenchima tiroideo sano di controllo.

8.3.1 Mast cell triptasi positive

Come primo passo nell’analisi dei risultati abbiamo voluto distinguere l’espressione delle mast cell intratumorali, peritumorali ed extratumorali confrontandole con i dati anantomo-clinici, con la presenza di macrofagi e con l’espressione immunoistochimica delle chemochine studiate.

8.3.1.1 Mast cell triptasi positive intratumorali

La presenza di mast cell intratumorali è significativamente correlata con una maggiore dimensione della neoplasia (p=0,0436) e con l’infiltrazione e superamento della capsula tumorale (p=0,0210). Non si è invece osservata correlazione statistica con il sesso, l’età alla diagnosi, l’istotipo, l’infiltrazione della capsula tiroidea, la multifocalità, la bilateralità e la presenza di metastasi linfonodali. Inoltre la presenza e l’intensità della tiroidite sono risultati fattori indipendenti dalla presenza di mast cell intratumorali.

Non si è riscontrata una diretta relazione tra i macrofagi CD68 positivi e le mast cell intratumorali (p=0,0566), sebbene l’andamento dei dati statistici sia apparentemente orientato verso la proporzionalità inversa.

Infine non è stata dimostrata una significatività statistica tra le mast cell intratumorali e l’espressione delle chemochine CXCL1 e CCL2, mentre una proporzionalità diretta (p=0,0014) è stata dimostrata rispetto all’espressione di CXCL10.

Esiste una correlazione statisticamente significativa tra i mastociti e la presenza di mutazioni del gene BRAF (p=0,0416).

8.3.1.2 Mast cell triptasi positive peritumorali

La presenza di mast cell peritumorali è significativamente correlata con la minore differenziazione tumorale (p=0,0061) e con l’infiltrazione della capsula tumorale (p=0,0031). Non c’è invece relazione con il sesso, l’età alla diagnosi, la dimensione, la multifocalità, la bilateralità e la presenza di metastasi linfonodali. Sebbene non sia presente una correlazione statistica (p=0,0618) con l’infiltrazione della capsula tiroidea, dall’analisi dei dati si può osservare che sono più numerosi i casi positivi per la triptasi peritumorale che infiltrano la capsula tiroidea, rispetto ai tumori confinati entro la stessa.

Anche in questo caso, la presenza di mast cell peritumorale e la tiroidite sono fattori indipendenti.

Non c’è significatività statistica rispetto alla presenza di macrofagi intratumorali, mentre è presente (p=0,0406) con i macrofagi peritumorali, con andamento direttamente proporzionale.

Infine anche in questo sottogruppo è stata osservata una significatività (p=0,0041) inversamente proporzionale con l’espressione tumorale di CXCL10. Nessuna correlazione è invece presente con CXCL1 e CCL2 e con le mutazioni di BRAF.

8.3.1.3 Mast cell triptasi positive extratumorali

Nessuna relazione statistica caratterizza questo sottogruppo con parametri anatomo- clinici, macrofagi CD68 positivi ed espressione di chemochine.

Mast cell triptasi positive A: intratumorali; B:peritumorali