6.LE NUOVE PROPOSTE: MICRONEEDLE PATCHES
6.1 Il cerotto che controlla la glicemia
Un tentativo di rispondere alla domanda è stato messo in atto nell’ Università della Carolina del Nord, nel 2015-2016, dove è stato progettato un cerotto costituito da cellule beta pancreatiche in grado di secernere insulina attraverso microaghi integrati, minimamente invasivi e indolori, il tutto in risposta alle necessità fisiologiche.
Il concetto della somministrazione transdermica risulta essere interessante dal momento che appare come una strada possibile e non invasiva per l’assunzione di insulina da parte del soggetto diabetico che ne necessita, anche se l’applicabilità non è così semplice come può apparire ad una prima analisi. Infatti l’insulina non ha le caratteristiche chimico-fisiche per superare facilmente lo strato
corneo, che funge da spessa barriera nei confronti di sostanze esterne che devono raggiungere l’epidermide.
Il sistema è costituito da una componente cellulare viva, le cellule beta pancreatiche, ed un sistema sintetico di rilevazione dei livelli di glucosio. Il cerotto è infatti costituito da vescicole a base di ialuronato di sodio sensibile all’ipossia. In realtà il sistema di controllo della glicemia è stato introdotto successivamente. Infatti, in un primo tempo il progetto prevedeva un cerotto costituito esclusivamente dalle cellule beta incapsulate, l’acido ialuronico ed i microaghi. (36)
L’iniziale aspettativa era che in condizioni di iperglicemia, il glucosio potesse diffondere attraverso il microago per interagire con le cellule beta incapsulate nel microgel di alginato del cerotto inducendole a secernere insulina. Questo primo tipo di cerotto non era in grado di rispondere efficacemente allo stato iperglicemico poiché il glucosio non era in grado di diffondere sufficientemente attraverso gli aghi e questo comportava una secrezione eccessiva di insulina.
Dopo i fallimentari risultati del primo studio condotto nel 2015, il gruppo di scienziati diretto dal Professore Zhen Gu, ha introdotto un amplificatore del segnale di glucosio alla matrice del cerotto in modo da innescare efficacemente la risposta cellulare. (37) Tale
amplificatore (GSA) è presentato con nanovescicole polimeriche auto-assemblate che contengono tre enzimi: la glucosio ossidasi, la alfa-amilasi e la glucoamilasi. L’amplificatore è dotato di materiali sensibili all’ipossia: acido ialuronico funzionalizzato con nitroimidazolo attraverso un legame ammidico. La componente sensibile all’ipossia sono dunque i gruppi di nitroimidazoli che vengono ridotti a amminoimidazoli. Mentre il gruppo nitroimidazolico è idrofobico, quello amminoimidazolico è idrofilico e facilita il dis- assemblaggio del GSA. L’amplificatore si dissocia in risposta all’ossidazione del glucosio da parte della glucosio ossidasi la quale consuma il glucosio presente in concentrazione elevata, visto lo stato di iperglicemia, oltre a consumare ossigeno la cui carenza determinerà lo stato ipossico a cui è sensibile il nitroimidazolo. La reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi risulta:
A questo punto l’altro enzima rilasciato, la alfa-amilasi, idrolizzerà l’alfa-amilosio incorporato nella matrice del microago in disaccaridi e trisaccaridi i quali saranno a loro volta convertiti in glucosio da parte dell’ultimo enzima rimasto, la glucoamilasi. Questo glucosio risulterà come una forma di accumulo glucidico concentrato che diffonderà efficacemente entro le cellule beta pancreatiche incapsulate e posizionate esternamente. Le cellule stimolate dal glucosio rilasceranno insulina che andrà a distribuirsi nella rete vascolare e linfatica. Nella Figura 15 è indicato schematicamente il principio attraverso il quale funziona il sistema.
FIGURA 15. Schema del principio di funzionamento dei microneedle-array patch integrati con cellule beta pancreatiche in assenza ed in presenza di GSA. A) senza GSA non si ha un significativo rilascio insulinico né in normo che in iperglicemia. B) con il GSA si ha una significativa promozione nel rilascio di insulina durante iperglicemia. I MN patch sono costituiti da acido ialuronico incluso in strati di alfa-amilosio e GSA, dalla punta alla base dell’ago.
Per valutare in vitro la capacità di risposta al glucosio dell’amplificatore di segnale, sono state analizzate le vescicole sottoponendole a varie concentrazione di glucosio: il livello tipico di iperglicemia, 400 mg dL-1; il livello di glicemia nella norma,100 mg dL- 1 ed un livello di controllo di 0 mg dL-1.
Attraverso un microscopio ad emissione di elettroni è stato possibile verificare che l’amplificatore del segnale di glucosio (GSA), quando inserito nella soluzione con 400 mg dL-1 di glucosio, dava luogo a
modifiche morfologiche graduali da 20 minuti a 6 ore, coerenti con il declino nella dimensione media idrodinamica. Al contrario, il GSA incubato senza glucosio o nella soluzione con 100 mg dL-1 di
glucosio, mostrava dimensione idrodinamica stabile delle particelle e nessun apprezzabile cambiamento morfologico.
Chiaramente è stata valutata anche la cinetica del rilascio e della distribuzione degli enzimi fuoriusciti dalle vescicole dissociate attraverso analisi della fluorescenza degli stessi preventivamente marcati con isotiocianato di fluorescina. Il risultato dell’analisi dimostra come l’intensità della fluorescenza diminuisca progressivamente e mostri una omogenea distribuzione dopo 2 ore, suggerendo che gli enzimi si erano dispersi uniformemente nella soluzione. Analizzando la cinetica di rilascio degli enzimi nelle altre due condizioni NORMALE e CONTROLLO, non è stato possibile apprezzare nessuna quantità enzimatica significativa antro 24 ore di incubazione.
Le cellule beta pancreatiche sono state estratte da isolotti pancreatici di topo per essere incapsulate alla concentrazione di 107 in microgel
di alginato e collagene di tipo IV.
La verifica che le cellule incapsulate mantengono la loro funzionalità è stata eseguita analizzando per 3 giorni consecutivi la loro secrezione di insulina sotto stimolazione del glucosio.
Il cerotto a microaghi è stato prodotto con un approccio di micro- modellatura. In questo modo è stato progettato e realizzato un dispositivo costituito da ben 400 aghi piramidali su di un cerotto di 10 mm2 con una struttura stratificata che vedeva gli amplificatori del
segnale disposti nella parte anteriore, nella punta, dei singoli aghi e le cellule beta pancreatiche incapsulate disposte nella parte posteriore del cerotto. L’alfa-amilosio così come la matrice reticolata di acido ialuronico sensibile all’ipossia, si trovano nella parte intermedia del cerotto e costituiscono la porzione centrale dei microaghi. Applicando il cerotto su cavie da laboratorio, rese diabetiche con somministrazione di streptomicina, è stato possibile osservare che il microago è in grado di penetrare ad una profondità di circa 200 µm nell’epidermide permettendo quindi all’amplificatore del segnale di glucosio di essere esposto in tempo reale al fluido
interstiziale. Inoltre le cavie sono state sottoposte alla somministrazione transcutanea di una vasta varietà di campioni di microaghi così da indagare anche in vivo l’efficacia del dispositivo in risposta al glucosio. Solo nelle cavie trattate con cerotto a microaghi integrato con segnali di risposta al glucosio vivo-sintetici, i livelli di glucosio declinavano rapidamente fino a 200 mg dL-1 entro 2 ore e
conservavano un livello significativamente ridotto per 6 ore, senza mostrare picchi iperglicemici o ipoglicemici. Al contrario negli altri gruppi il livello del glucosio nel sangue diminuiva solo nella prima ora e successivamente le cavie tornavano a mostrare uno stato di iperglicemia. Risultati e modalità di analisi sono illustrati e spiegati in Figura16.
Inoltre per valutare se il cerotto a microaghi fosse in grado di modulare i livelli di glucosio senza causare rischi potenziali di ipoglicemia, ad un gruppo di animali è stato sostituito il cerotto dopo 6 ore dall’applicazione precedente. Con il secondo trattamento dal cerotto non veniva secreta insulina in eccesso poiché dopo 6 ore dal trattamento precedente ancora la cavia mostrava una glicemia nella norma. Inoltre la somministrazione dei cerotti in animali non diabetici mostrava un insignificante rilascio di insulina tale da mantenere i livelli di glucosio del sangue entro il range della normalità. Questo a sottolineare come il cerotto sia sensibile all’iperglicemia e come non tenda a rilasciare l’insulina in mancanza di un reale e sufficiente segnale iperglicemico. Anzi il cerotto applicato successivamente al
FIGURA 16. Profili di glicemia in topi diabetici trattati con diverse tipologie di cerotto: senza cellule beta pancreatiche (w/o GRS); con cellule beta vive (L-GRS); con cellule beta di sintesi (S-GRS); con cellule beta vive e di sintesi (L-S GRS); con cellule beta vive e di sintesi ma senza glucosio ossidasi (L-S GRS (w/o GOx)), con cellule beta vive e di sintesi ma senza alfa-amilosio (L-S GRS (w/o AM)).
primo permetteva di prolungare l’efficienza del trattamento (Figura 17).
In ultimo è stata analizzata la potenziale citotossicità e la sicurezza del cerotto a microaghi verso la pelle: entro 8 ore dalla rimozione del cerotto la pelle recupera rapidamente la propria morfologia senza mostrare alcun segno di infiammazione.
Per quanto l’applicabilità della tecnologia sopra illustrata rimanga ancora non estesa alla sfera umana, rimane di fondamentale importanza l’introduzione di un concetto e di una visione innovativa rispetto alla somministrazione insulinica.
Col tempo ci possiamo aspettare quindi un’ottimizzazione del progetto di partenza utilizzando cellule beta pancreatiche di suino o umane ottenute a partire da cellule staminali oppure un miglioramento nelle tecniche di amplificazione del segnale fisiologico così da garantire una copertura di insulina anche nei casi in cui il segnale biologico fosse insufficiente.