1.10 I trasportatori dei metall
2.1 Clonaggio del gene UPr51;1 e UPr51;2 per la produzione di piante transgeniche
La produzione di piante transgeniche è iniziata dal clonaggio dei geni in vettori binari. Per far ciò è stata utilizzata la tecnologia Gateway®, basata sull’utilizzo di sequenze di ricombinazione invece che dei convenzionali siti di restrizione.
In uno studio precedente, i geni in oggetto sono stati clonati da cDNA di Populus x euramericana clone I-214 nel vettore pDONR207 (figura 2.1) che ha consentito di allestire la reazione di ricombinazione BP tra UPr51;1-attB e UPr51;2-attB con il medesimo vettore. Per far ciò è stato utilizzato il kit “Gateway BP ClonaseII Enzyme Mix” (Invitrogen) seguendo il protocollo suggerito dal produttore. La reazione è stata incubata a 25 °C over night e, in seguito, è stata fatta terminare tramite incubazione a 37 °C per 10 minuti in presenza di 1 µl di proteinasi K (2 µg/µl).
Figura 2.1 Mappa del vettore pDONR207. CcdB gene codificante una tossina batterica che si lega alla DNA
43 Successivamente, le cellule competenti di E. coli ceppo DH5α sono state trasformate con il vettore pDONRUPr51;1 e pDONRUPr51;2 (entry clone) mediante elettroporazione effettuata con l’elettroporatore “BIORAD Gene Pulser Xcell” impostato con i seguenti parametri:
Voltaggio 2,5 kV Capacità 25 µF Resistenza 200 Ω Cuvette 2 mm.
Nella trasformazione sono stati utilizzati 2 µl del mix della reazione BP. Trascorsa circa un’ora di recovery in agitazione a 37 °C in 500 µl di mezzo LB, le cellule sono state piastrate su agar LB con Gentamicina (50 mg/l). Lo screening delle colonie è avvenuto tramite colony-PCR. Questa tecnica che utilizza la crescita batterica come stampo ha previsto l’utilizzo dei primers propri del gene (tabella 2.1) mediante il mix:
1 µl Buffer (10 X) 0,6 µlMgCl2 (50 mM) 0,2 µl dNTP (10 mM)
0,2 µl primer UPr51-BglII Fwd (10 µM) 0,2 µl primer UPr51-Xba Rev (10 µM) 0,3 µl Taq
7,5 µl H2O.
Le condizioni di reazione sono state le seguenti: denaturazione iniziale 2 minuti a 95 °C
• denaturazione 20 secondi a 95 °C • annealing 20 secondi a 53 °C • estensione 1,15 minuti a 72 °C
44 per 39 cicli
fine reazione 5 minuti a 72 °C.
Al termine della reazione di PCR, ad ogni campione è stato aggiunto il loading buffer 6X (tabella 2.2). I prodotti di PCR sono stati, quindi, caricati su gel al 1% di agarosio con bromuro di etidio (1 µg/µl) e fatti correre per 20 minuti in tampone TBE 0,5 X (tabella 2.3) con una tensione fissa di 100V. Il gel è stato, poi, visualizzato e fotografato tramite il “ChemiDoc™ XRS+ System” della BIO-RAD.
Tabella 2.1 Sequenza primer utilizzati per il clonaggio genico.
Tabella 2.2 Componenti loading buffer 6X.
Primer Sequenza
UPr51-BglII Fwd 5’-AGATCTATGCCTTGTTTGAAAACTCC-3’
UPr51-XbaI Rev 5’-TCTAGATATCCCAAATCATAACAACTGC-3’
pDONR207 Fwd 5’-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3’
pDONR207 Rev 5’-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3’
UPR51- gateway Fwd 5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCTTGTTTGAAAACT-3’ UPR51- gateway Rev 5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAATCCCAAATCATAAC- 3’
Loading buffer 6X
Reagente Concentrazione
Glicerolo 30% (v/v)
45 Tampone TBE 5X Reagente Concentrazione Tris 5,4% (w/v) Acido borico 2,75% (w/v) EDTA 0,5M pH 8 2% (v/v)
Tabella 2.3 Componenti Buffer TBE 5X.
Le colonie risultate positive sono state inoculate nel mezzo liquido LB con Gentamicina (50 mg/l) ed incubate over night in agitazione a 37 °C. Dagli inoculi è stato estratto il DNA plasmidico tramite il kit della OMEGA bio-tek “E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I” seguendo le istruzioni del produttore. Per verificare la corretta ricombinazione dell’inserto con il vettore pDONR sono state seguite delle PCR utilizzando una coppia di primer (tabella 2.1).
46 Il DNA plasmidico è stato, infine, disidratato, tramite incubazione a 65 °C fino a completa evaporazione dell’acqua, per poter essere inviato per il sequenziamento presso la ditta Primm. Successivamente, sono state allestite due reazioni di ricombinazione LR tra i vettori pDONRUPr51;1, pDONRUPr51;2 e i due vettori binari pMDC45 e pEG201 (destination vector per la localizzazione mediante GFP6 (figura 2.2) e tag HA (figura 2.3), entrambi sotto il controllo del promotore CaMV35S) utilizzando il kit “Gateway LR Clonase II Enzyme Mix” (Invitrogen) seguendo il protocollo suggerito dal produttore. Le reazioni sono state incubate a 25 °C per 5 ore.
Figura 2.3 Mappa pEARLEY GATE 201. Resistenza alla Kanamicina per selezione batterica e
resistenza al BASTA per la selezione delle piante transgeniche. Tag dell’emoagglutinina alla porzione N-terminale.
La trasformazione batterica e lo screening delle colonie sono state eseguite come sopra riportato, utilizzando 1 µl di reazione LR fatto reagire con 0,1 µl di proteinasi K (2 µg/µl). I restanti mix di reazione sono stati lasciati in incubazione over night nelle condizioni descritte.
47 Successivamente, le cellule competenti di E. coli ceppo DH5α sono state trasformate con i vettori pEG201UPr51;1-2 e pMDC45-UPr51;1-2 (expression vector) mediante elettroporazione come descritto sopra utilizzando 1 µl del mix della reazione LR, e piastrate su agar LB con Kanamicina (50 mg/l). Lo screening delle colonie è avvenuto, come riportato sopra, tramite colony PCR utilizzando i primer riportati nella tabella 2.1.
L’estrazione del DNA plasmidico è avvenuto tramite il kit riportato precedentemente. Come ulteriore controllo, sono state eseguite delle reazioni di PCR per verificare la corretta ricombinazione dell’inserto con i vettori pMDC45 e pEG201, come descritto sopra, utilizzando due coppie di primer:
• UPr51 BglII forward e UPr51 XbaI reverse (tabella 2.1), utilizzati ad una temperatura di annealing di 53 °C per entrambe le isoforme.
• UPr51 gateway Fwd e Rev (tabella 2.1), utilizzati ad una temperatura di annealing di 53 °C per entrambe le isoforme.
Infine le cellule competenti “ElectroMAX di A. tumefaciens LBA4404” (Invitrogen) sono state trasformate con i vettori pMDC45UPr51;1-2 e pEGUPr51;1-2 mediante elettroporazione seguendo il protocollo del produttore. A 20 µl di cellule sono stati aggiunti 100 ng di DNA plasmidico e la trasformazione è avvenuta mediante l’elettroporatore “BIORAD Gene Pulser Xcell” impostato con i seguenti parametri:
Voltaggio 2,0 kV Capacità 25 µF Resistenza 200 Ω Cuvette 1 mm.
Trascorse 3 ore di recovery in agitazione a 30 °C in 1 ml di mezzo LB, l’elettroporato è stato piastrato su agar LB con Kanamicina (50 mg/l) e Streptomicina (100 mg/L). Le piastre sono state mantenute in incubazione a 30 °C per 48 ore. Lo screening delle colonie di A. tumefaciens è
48 avvenuto tramite colony PCR come descritto sopra. Le colonie risultate positive sono state inoculate in LB contenente Kanamicina (50 mg/l), Streptomicina (100 mg/l) e 2mM di MgSO4.
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