Ipotesi sulle funzioni dei gruppi di geni Zip

L’analisi tramite Real Time PCR sono state effettuate su campioni estratti da radici, fusti, foglie sviluppate e in via di sviluppo. Questi organi, però, sono formati da diversi tessuti che presentano una propria espressione genica e, quindi, una propria modulazione dei geni Zip. I trasportatori della famiglia ZIP sono riconosciuti dalla letteratura come proteine determinanti coinvolte nell’assorbimento dei metalli dal suolo (Zn, Mn, Fe e Cu) (Milner et al., 2013). I nostri risultati hanno permesso di misurare una risposta dei livelli d’espressione organo-specifica indotta dallo zinco confermando il coinvolgimento di questi trasportatori nell’uptake, nel trasporto dei metalli pesanti negli organelli della cellula e/o nella traslocazione.

Alla luce dei risultati ottenuti da Romeo et al. (2014, a), il clone I-214 accumula lo zinco principalmente nelle radici e in quantità minore nelle foglie; infatti, nelle radici trattate con 1 mM di Zn, questo raggiunge concentrazioni di 3030 ± 544 µg g-1 di peso secco mentre nelle foglie raggiunge i 786 ± 71 µg g-1 di peso secco a seguito di trattamento con 1 mM di Zn. Queste concentrazioni sono determinate sia dai trasportatori da noi studiati che da altri appartenenti ad altre famiglie che determinano l’accumulo nelle radici ed una bassa traslocazione verso le foglie in cui la concentrazione del metallo è minore.

La prova di stress da zinco condotta in vitro su Populus alba clone Villafranca ci ha permesso di misurare i livelli d’espressione dei geni Zip in questo sistema e in questa specie differente. I risultati ottenuti hanno mostrato che il comportamento di questi geni è quasi sempre differente, ed a volte opposto, a quello rilevato sul Populus x euramericana clone I-214 trattato in idroponica. Questo risultato è probabilmente dovuto al differente stadio di crescita (le piantine cresciute in vitro non presentano crescita secondaria), ai diversi substrati utilizzati nei due sistemi e alle diverse specie utilizzate.

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Zip1 presenta una sotto espressione statisticamente significativa a livello di radici, di foglie

sviluppate e in via di sviluppo a seguito del trattamento con lo zinco. Questa risposta è probabilmente dovuta al fatto che questi geni sono localizzati sulle membrane degli organelli cellulari; infatti, la diminuzione di espressione dei geni zip1 potrebbe essere indotta per diminuire l’accumulo dello zinco in questo compartimento dato l’abbassamento del flusso in uscita. Questo sarebbe in accordo con quanto riportato da Milner et al. (2013) sull’omologo AtZip1 di Arabidopsis

thaliana di cui è stata dimostrata la capacità di trasportare zinco e manganese, la localizzazione a

livello della radice e delle nervature delle foglie, e la localizzazione vacuolare di questo trasportatore.

Zip2 manifesta una sotto espressione a livello di radice e fusto suggerendo un ruolo nel trasporto

dello zinco. Dati i risultati ottenuti, si può supporre il coinvolgimento della proteina nell’uptake dello zinco a livello di plasmalemma, che diminuirebbe in presenza di un eccesso di Zn. Questo comportamento concorda con quello dell’omologo AtZIP12 di Arabidopsis thaliana che trasporta zinco e manganese e viene sovra espresso in carenza di zinco (Milner et al.,2013).

Zip3 presenta un aumento dell’espressione statisticamente significativo a seguito del trattamento

solo nelle radici. Si può supporre che, dati i risultati, zip3 sia localizzato a livello di plasmalemma dove trasporta con maggiore affinità metalli diversi dallo zinco, suggerendo il suo coinvolgimento nella traslocazione in altri organi. Tuttavia, poiché l’unico dato presente in letteratura riguarda l’omologo di Arabidopsis AtIRT1che risulta principalmente coinvolto nel trasporto di ferro a livello radicale e risulta sovra espresso in carenza di ferro (Grotz et al., 1998; Hall e Williams, 2003), non si può escludere che in eccesso di zinco, questo minerale induca una competizione con gli altri metalli generando una abbassamento dei livelli di micronutrienti nella pianta. Per contrastare questo fenomeno la pianta probabilmente potrebbe aumentare l’espressione di trasportatori che presentano una più alta affinità per metalli diversi dallo zinco e diminuire l’espressione di quelli più affini per questo.

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Zip4 mostra un’espressione significativa solamente a livello radicale dove risulta sovra espressa in

eccesso di zinco. La sovra espressione a livello radicale suggerisce un ruolo nel sequestro citoplasmatico, oppure, in accordo con quanto osservato in AtZIP7 di Arabidopsis (Milner et al. 2013), potrebbe essere coinvolto nell’assorbimento di metalli diversi dallo zinco come per zip3. Infatti, in Arabidopsis è coinvolto nel trasporto di ferro, manganese e zinco e viene sovra espresso in carenza di ferro.

Zip5 presenta una variazione dell’espressione genica statisticamente significativa solo a livello di

radici e fusto dove risulta sotto espresso. Questo risultato suggerisce un suo coinvolgimento nell’uptake nella radice. Infatti, il comportamento di questo gene concorda con il comportamento dell’omologo AtIRT2 di Arabidopsis che risulta espresso a livello delle radici e viene sovra espresso in carenza di zinco o di ferro (Wintz et al., 2003).

Zip6 presenta, in tutti gli organi, una sotto espressione significativa a seguito del trattamento con

zinco, fino a portare i livelli di espressione quasi a zero nelle foglie. Questo comportamento potrebbe far pensare al suo coinvolgimento nell’efflusso dello zinco dagli organelli cellulari o nell’uptake. Questa ipotesi sarebbe in accordo con l’omologo AtZIP4 di Arabidopsis; infatti, secondo Grotz et al. (1998), questo gene sarebbe sovra espresso nelle radici e nella parte aerea in carenza di zinco.

Interessante notare che questa sotto espressione viene mostrata anche nel Populus alba trattato con lo zinco in vitro. Probabilmente questo gene possiede un ruolo principale nella risposta all’eccesso di zinco e nella difesa della pianta dallo stress causato dal metallo.

Zip7 risulta espresso in tutti gli organi e presenta una sotto espressione statisticamente significativa

solo a livello di foglie sviluppate. Questo gruppo potrebbe essere coinvolto nella traslocazione dello zinco nelle parti aeree. Pertanto, un eccesso del metallo potrebbe indurre una sotto espressione proprio nelle foglie, organo attivamente coinvolto nella fotosintesi e, quindi, suscettibile ad un livello eccessivo di zinco. Il nostro risultato è parzialmente coerente con quanto osservato nel suo

105 omologo AtZIP6 in Arabidopsis, in cui l’espressione nelle radici e nella parte aerea risulta stabile anche variando i livelli di zinco (Milner et al., 2013).

Zip8 viene espresso in tutti gli organi, ma solo nel fusto abbiamo misurato una sotto espressione

statisticamente significativa. Dati i livelli rilevati si potrebbe ipotizzare un ruolo nella traslocazione dello zinco nelle parti aeree. L’omologo AtZIP11 in Arabidopsis viene anch’esso espresso in tutti gli organi ed è capace di trasportare zinco e manganese (Milner et al., 2013).

Zip9 viene espresso in tutti gli organi della pianta ma solo nelle radici la sovra espressione a seguito

del trattamento è statisticamente significativa. Dall’analisi dei nostri risultati si può ipotizzare una doppia modalità d’azione organo specifica. Nelle radici potrebbe essere coinvolto nel trasporto a livello di plasmalemma e di vacuolo al fine di accumulare lo zinco in questo organo. Questo dato è in accordo con i risultati di accumulo preferenziale nella radice come riportato da Romeo et al., (2014, a). I nostri dati non concordano con quanto riportato da Milner et al. (2013) sull’omologo

AtZIP2 in Arabidopsis in cui è riportata osservata un’espressione solo nella radice.

Zip10, zip11 e zip12 presentano un comportamento simile mostrando una sotto espressione

statisticamente significativa solo a livello di fusto. Questo dato suggerisce un ruolo di regolazione dello zinco verso il citoplasma. I risultati ottenuti su zip10 sono in accordo con quanto riportato in letteratura da Wang et al. (2011) sull’omologo AtZTP29 in Arabidopsis che riportano il suo coinvolgimento nella risposta allo stress salino grazie al suo ruolo di trasportatore di zinco sulla membrana del reticolo endoplasmico. I risultati ottenuti su zip11 sono in accordo con quanto riportato da Rampey et al. (2013) su AtIAR1 omologo in Arabidopsis, in cui affermano che il trasportatore è coinvolto nell’efflusso di zinco dal reticolo endoplasmico ed è indirettamente responsabile dell’attivazione delle auxine coniugate. Il risultato ottenuto su zip12 non è paragonabile con dati di letteratura sull’omologo che possano confermare la nostra ipotesi.

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Zip10 e zip11 presentano nel fusto del Populus alba trattato in vitro con lo zinco un andamento

opposto a quello rilevato nel Populus x euramericana trattato in idroponica probabilmente dovuto al diverso stadio di crescita delle piante che nel primo caso presentano un habitus erbaceo mentre nel secondo sistema presentano fusti legnosi dovuti alla crescita secondaria.

Le ipotesi effettuate sono state proposte tenendo presente che gli ZIP sono dei trasportatori che non utilizzano ATP, il cui orientamento del flusso di metalli segue un gradiente elettrochimico. Inoltre, si deve tener conto della possibilità di espressione differenziale nei vari tessuti dello stesso organo. Quindi un futuro studio di localizzazione nel tessuto e di localizzazione subcellulare permetterebbe di comprendere meglio il ruolo di questi geni in risposta ad eccesso di zinco. Lo studio di altre famiglie di trasportatori sarebbe di ulteriore aiuto nella comprensione della complessa omeostasi dei metalli nelle piante. Infatti, i valori da noi misurati sono influenzati direttamente dai livelli dei metalli nella pianta e indirettamente dall’espressione di altri trasportatori che modificano la fisiologia della pianta.

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