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La proteina monoacilglicerolo lipasi (MAGL) è un enzima appartenente alla famiglia delle α/β-idrolasi la cui espressione è massima al livello del cervello, del fegato e del tessuto adiposo. Essa regola la degradazione degli endocannabinoidi, in particolare esercita la sua azione sui monoacilgliceroli, che idrolizza per dare glicerolo e acidi grassi. Il substrato endogeno della MAGL è l'endocannabinoide 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), il quale interagisce con entrambi i recettori cannabinoidi, sia CB1 che CB2.

Oltre ad essere coinvolta nella modulazione del Sistema Endocannabinoide, la MAGL riveste un ruolo fondamentale nel metabolismo lipidico.

Queste implicazioni la rendono pertanto un interessante target farmacologico, in quanto gli effetti classicamente associati con l'inibizione della MAGL sono di tipo antinocicettivo e di ipomotilità; inoltre la MAGL sembra essere coinvolta nel rilascio di amminoacidi che fungono da precursori per la sintesi di prostaglandine pro-infiammatorie, di conseguenza il blocco della MAGL induce anche una diminuzione delle prostaglandine e del trombossano nel cervello.

La MAGL è inoltre espressa nelle cellule dei tumori aggressivi; qui la sovraespressione della MAGL determina una aumento dei livelli di acidi grassi, che vengono liberati dalle riserve di triacilgliceroli immagazzinate negli adipociti. Gli acidi grassi sono utilizzati dalle cellule cancerose come precursori per la sintesi di molecole segnale pro-tumorigeniche. Non è un caso che i tumori primari caratterizzati da livelli elevati della MAGL risultano avere una maggiore patogenicità e maggior potenziale invasivo.

Sulla base di questi dati, negli ultimi anni, la crescente consapevolezza delle numerose funzioni in cui è implicato il Sistema Endocannabinoide, ha spinto i chimici farmaceutici a sviluppare strumenti per esplorare le vie che governano la degradazione degli endocannabinoidi e quindi a validare la MAGL come un target terapeutico. Ad oggi sono stati individuati diversi inibitori della MAGL che agiscono in modo irreversibile reagendo principalmente con delle cisteine presenti nel sito attivo oppure con la serina nucleofila della triade catalitica.

In particolare, gli effetti principali dovuti al blocco della MAGL derivano dall'azione sul sistema cannabinoide: l'inibizione della MAGL determina infatti un effetto antidolorifico e antiinfiammatorio dovuto al controllo dei livelli di acido arachidonico, ma sembra avere anche benefici di tipo palliativo o addirittura protettivo nei confronti delle malattie neurodegenerative come il Parkinson o l'Alzheimer. Altre interessanti implicazioni

terapeutiche si hanno anche nel controllo dell'ansia e nella dipendenza da droghe.

Probabilmente però, l'aspetto di maggior rilevanza terapeutica riguarda la sovraespressione della MAGL nelle cellule tumorali, in quanto una sua inibizione farmacologica potrebbe determinare una diminuzione della proliferazione, dell'invasività e della crescita incontrollata in vivo delle cellule tumorali.

Pertanto nella parte relativa alla sintesi di questo progetto di tesi è stata costruita una libreria di composti a struttura benziliden-ossazolonica allo scopo di individuare inibitori di tipo irreversibile delle MAGL.

Preliminari saggi di inibizione enzimatica hanno mostrato che i composti con attività più promettente sono quelli caratterizzati dalla presenza di una porzione bifenilica legata al ciclo ossazolonico; questo risultato è giustificato dal fatto che il sito attivo della MAGL si caratterizza per la presenza di un lungo tunnel idrofobico che termina con un fondo polare, all'interno del quale si collocano bene molecole aventi una porzione idrofila legata ad una coda lipofila.

Durante i successivi studi computazionali abbiamo cercato in primo luogo di individuare il più plausibile meccanismo di interazione fra i composti sintetizzati e la MAGL. In particolare, sulla base delle caratteristiche chimiche dei composti sintetizzati e dei dati riportati in letteratura per altri inibitori di tipo irreversibile, abbiamo ipotizzato quattro possibili meccanismi:

• Addizione di Michael su Ser122 • Addizione di Michael su Cys242

• Apertura del ciclo ossazolonico su Ser122 • Apertura del ciclo ossazolonico su Cys242

Per verificare quale delle ipotesi fosse la più plausibile abbiamo sottoposto tutti i ligandi sintetizzati a calcolo di docking covalente con il programma GOLD; i risultati della procedura di docking sono stati analizzati confermando che tutte e quattro le ipotesi formulate erano valide e plausibili. Successivamente i risultati del docking sono stati valutati tenendo conto anche dei risultati dei saggi di inibizione enzimatica effettuati sui composti sintetizzati, dei dati sperimentali disponibili per l'inibitore irreversibile CAY 10499 (inibitore sia della MAGL che della FAAH, il quale agisce tramite legame alla serina catalitica) e, in

ultima analisi, dei risultati del docking del composto benziliden-ossazolonico modello CG- 231 sull'enzima FAAH. Sulla base di queste osservazioni è stato stabilito che il meccanismo di inibizione più plausibile dei composti a struttura benziliden-ossazolonica sia l'addizione di Michael sull'amminoacido Cys242.

La stabilità delle interazioni di questi composti con la MAGL è stata poi confermata attraverso simulazioni di dinamica molecolare utilizzando il programma AMBER.

Successivamente si è passati ad uno studio di relazioni struttura-attività (SAR) su una libreria di 50 composti, derivanti da drug design, che avessero la stessa struttura base benziliden-ossazolonica, legata però a sostituenti di natura diversa, allo scopo di individuare nuove interazioni con il sito attivo della MAGL. Questo passaggio, che rappresenta il primo step per la costruzione di un modello farmacoforico, si articola in due fasi:

1. Docking dei composti disegnati per analizzarne le interazioni;

2. Simulazione di dinamica molecolare sui composti che dopo il docking sembravano più promettenti per valutare se le interazioni individuate fossero stabili.

A seguito di questa analisi, il risultato di maggior rilevanza si è avuto con il composto Lig 31, il quale si caratterizza per una porzione ftalimmidica legata allo scheletro benziliden- ossazolonico, sostituita con una catena di tipo amminoetereo e con un gruppo trifluorometilico. Nonostante l'interazione individuata nel docking fra Leu205 e uno dei carbonili dell'anello ftalimmidico non sia mantenuta durante la simulazione di dinamica, una nuova interazione, stabile per il 50% della dinamica, è stata individuata fra l'NH ftalimmidico e la Pro178.

Infine un altro risultato degno di nota si è avuto sottoponendo a docking e successiva dinamica composti caratterizzati da un terzo anello benzenico, per valutare se l'interazione con la MAGL si mantenesse in modo efficace anche in presenza di un'ulteriore porzione lipofila. I dati ricavati dalla dinamica ci hanno permesso di valutare che, a prescindere dalla posizione relativa dei due sostituenti fenilici sullo scheletro benziliden-ossazolonico, un terzo anello aromatico si sistema in un'altra tasca lipofila situata nel sito catalitico della MAGL. Questo risultato, in accordo con ciò che ci aspettavamo, deriva dal fatto che il sito attivo della MAGL è costituito da un lungo tunnel lipofilo, all'interno del quale le molecole da noi disegnate e analizzate possono collocarsi formando interazioni lipofile con le varie tasche idrofobiche, costituite principalmente da leucine ed isoleucine.

benziliden-ossazolonica possono costituire una classe di nuovi potenziali inibitori di tipo irreversibile della MAGL, dei quali abbiamo cercato di definire un meccanismo d'azione. Inoltre è stato possibile individuare nell'aggiunta di un terzo anello fenilico una modifica che potrebbe determinare maggiore affinità e selettività per la monoacilglicerolo lipasi. Questo motivo strutturale potrà in futuro essere oggetto di ulteriori ed opportune modifiche allo scopo di trovare composti con attività più elevata rispetto a quelli finora sintetizzati, tenendo anche conto, nel cercare nuove interazioni, dell'importante ruolo che sembra essere rivestito dalla Pro178.

6. Sintesi:

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