DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Tesi di Laurea:
SINTESI E STUDI COMPUTAZIONALI DI NUOVI INIBITORI
COVALENTI DELLA MONOACILGLICEROLO LIPASI
Relatori: Prof. Filippo Minutolo
Dr. Tiziano Tuccinardi
Dr.ssa Carlotta Granchi
Candidato: Vittorio Bordoni
(mat. n° 441818)
Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-08
ANNO ACCADEMICO 2013-2014
Indice
1. Introduzione Generale...1
1.1 Breve introduzione sul Sistema Endocannabinoide[1]...2
1.2 Introduzione alla monoacilglicerolo lipasi...3
1.3 Struttura della monoacilglicerolo lipasi...5
1.4 MAGL e metabolismo lipidico...7
1.5 Implicazioni della MAGL nel Sistema Endocannabinoide...8
1.6 Potenzialità terapeutiche dell’enzima MAGL...9
1.7 Ruolo della MAGL nel cancro e strategie terapeutiche...10
1.8 Meccanismo catalitico...14
1.9 Inibitori della MAGL...15
2. Sintesi: Risultati e Discussione...19
2.1 Introduzione alla parte sperimentale...20
2.2 Schema generale di sintesi...22
2.3 Procedure Sintetiche...23
2.3.1 Tentativo di sintesi con microonde...23
2.3.2 Sintesi in condizioni termiche dei composti 3, 5, 7 e 10...25
2.3.3 Sintesi in condizioni termiche del composto 15...29
2.3.4 Sintesi in condizioni termiche dei composti 18, 23, 24 e 25...31
2.3.5 Tentativo di deprotezione del prodotto 21 con BBr3...36
2.3.6 Riduzione palladio-catalizzata del prodotto 23...37
2.3.7 Tentativo di sintesi del ciclo ossazol-5-onico...38
3. Saggi Biologici...39
4. Studi Computazionali: Risultati e Discussione...43
4.1 Analisi della struttura cristallografica...45
4.2 Meccanismo d'inibizione...46
4.2.1 Individuazione dei possibili meccanismi di legame...46
4.2.2 Docking covalente con il programma GOLD...48
4.2.3 Determinazione del meccanismo d'azione attraverso l'analisi dei risultati ottenuti...50
4.2.4 Dinamica Molecolare delle strutture benziliden-ossazoloniche...55
4.3 Studi di Relazioni Struttura-Attività (SAR)...57
5. Conclusioni e Prospettive Future...66
6. Sintesi: Procedure Sperimentali...71
6.1 Materiali e Metodi...72
6.2 Sintesi dei derivati benziliden-ossazol-5-onici...73
7. Studi Computazionali: Materiali e Metodi...89
7.1 Introduzione generale a GOLD...90
7.1.1 Preparazione dei file di input...90
7.1.2 Scelta della funzione di fitness...94
7.1.3 Scelta delle opzioni...95
7.1.4 Inizio del calcolo...97
7.1.5 Analisi dei risultati con UCSF CHIMERA...97
7.2 Introduzione generale ad AMBER...99
7.2.1 Funzionalità di AMBER...100
7.2.2 Preparazione dei file per LEaP...101
7.2.3 Preparazione dei file di input con LEaP...102
7.2.5 Simulazione di dinamica con PMEMD...104
7.2.6 Analisi della dinamica con PTRAJ...107
7.2.7 Analisi della dinamica con UCSF CHIMERA...109
Bibliografia...111
1. Introduzione
Generale
1.1 Breve introduzione sul Sistema Endocannabinoide
[1]E' stato effettuato un significativo numero di studi allo scopo di chiarire il ruolo biologico del Sistema Endocannabinoide (ECS), la sua funzione di controllo sulla salute e sulla malattia e il potenziale di un suo sfruttamento farmacologico. Il Sistema Endocannabinoide comprende:
• Due recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), il CB1 e il CB2;
• I loro ligandi endogeni, ovvero gli endocannabinoidi, i quali sono molecole lipidiche contenenti lunghe catene polinsature di acidi grassi, ammidi, esteri e eteri (esempi: l’anandamide e il 2-arachidonoilglicerolo);
• Gli enzimi che regolano la biosintesi degli endocannabinoidi, la loro degradazione e il loro livello tissutale.
L’anandamide appartiene al gruppo delle N-aciletanolammidi, essa è idrolizzata per mezzo di una idrolasi intracellulare, la fatty acid amide hydrolase (FAAH), che porta alla formazione di acido arachidonico e etanolammina. Il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG) è idrolizzato principalmente dalla monoacilglicerolo lipasi (MAGL). Altri endocannabinoidi che sono stati identificati, inclusa la virodamina e l’ N-arachidonoildopamina, derivano da un metabolismo non ossidativo dell’acido arachidonico; alcuni esempi sono le N-aciletanolammidi palmitoiletanolammide, stearoiletanolammide, oleoiletanolammide, linoleoiletanolammide, eicosapentanoiletanolammide e docosaesanoiletanolammide. Analoghi lipoammino acidi endogeni strettamente correlati all’anandamide sono stati identificati nel cervello dei mammiferi ed in altri tessuti ed includono l’N-arachidonoilglicina (NAGly), l’ N-arachidonoilalanina (NAAla), l’ N-arachidonoil L-serina e l’ N-arachidonoilGABA.
I recettori CB1 e CB2 sono recettori accoppiati a proteine Gi/o e sonocostituiti da sette
domini transmembranari. Essi mediano diverse risposte cellulari, in particolare possono inibire l’adenilato ciclasi e la produzione di cAMP, possono inattivare la MAPK, la fosfolipasi C, la sfingomielinasi e la fosfoinositide 3-chinasi (PI3K). I recettori CB1 sono espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) e in tessuti periferici. Recentemente, è stato visto che l'alterazione dell’ECS e/o la sovraespressione di recettori CB1 sono implicate in varie patologie come l’obesità, la sindrome metabolica, il diabete, l'Alzheimer. I recettori CB2 sono invece predominanti nelle cellule immunitarie, tuttavia sono stati individuati
anche in diversi tessuti periferici, soprattutto in condizioni patologiche come il cancro, indipendentemente dal tessuto di origine, come accade nel glioma e nell’astrocitoma.
Il profilo farmacologico di (endo)-cannabinoidi naturali e sintetici è stato ulteriormente esteso una volta che si è scoperta la loro capacità di interagire con recettori non CB, come il recettore orfano GPR55, i recettori canale potenziale-transienti (TRP), i canali ionici ligand-gated e il recettore nucleare attivante la proliferazione dei perossisomi (PPARs).
1.2 Introduzione alla monoacilglicerolo lipasi
La proteina MAGL (monoacilglicerolo lipasi) è un enzima solubile associato a membrana la cui espressione è massima a livello del cervello, del tessuto adiposo e del fegato. Appartiene alla famiglia delle serina idrolasi e manifesta la sua attività in modo preferenziale sui monoacilgliceroli (piuttosto che diacil- o triacilgliceroli), che idrolizza per ottenere glicerolo ed acidi grassi.[2] Uno di questi monogliceridi è l’endocannabinoide 2-AG,
un ligando endogeno che interagisce con i recettori CB1 e CB2, entrambi appartenenti alla classe di recettori accoppiati a proteine-G ed implicati nella risposta al Δ9
-tetraidrocannabinolo.
La comprensione del ruolo metabolico, fisiologico e patologico della MAGL è stata fortemente accelerata negli ultimi anni dalla sintesi di efficaci inibitori in vivo, potenti e selettivi, di cui l'esempio più significativo è costituito dalla molecola JZL 184. Il blocco della MAGL con l’inibitore covalente JZL 184 porta ad una notevole riduzione dell’idrolisi di 2-AG (>80%) con un conseguente aumento dei livelli di quest’ultimo. Gli effetti farmacologici finali sono di tipo antinocicettivo e di ipomotilità, entrambi classicamente associati all’attivazione dei recettori CB1. Inoltre il blocco della MAGL mostra differenze specifiche nel metabolismo dei monoacilgliceroli nei vari tessuti: nel cervello si hanno notevoli aumenti di 2-AG, mentre nei tessuti periferici spesso si verificano grandi cambiamenti in altri monoacilgliceroli, in accordo con il ruolo lipolitico della MAGL, come risultato finale dell’idrolisi dei trigliceridi.
Si pensa che l’endocannabinoide 2-arachidonoilglicerolo sia formato attraverso l’idrolisi di fosfolipidi per mezzo della fosfolipasi C (PLC) β o δ; l'enzima fosfolipasi rilascia diacilgliceroli (DAG) i quali vengono degradati ad opera della diacilglicerolo lipasi (DAGL)
α o β. La sintesi del 2-arachidonoilglicerolo avviene nei neuroni postsinaptici, esso si va poi a legare ai recettori CB1 presinaptici per modulare il rilascio presinaptico o interneuronale di neurotrasmettitori eccitatori o inibitori.
In aggiunta al ruolo di spegnimento del segnale del 2-AG, studi recenti hanno dimostrato che la MAGL rilascia amminoacidi, che costituiscono i precursori per la sintesi di prostaglandine pro-infiammatorie. É stato visto che un blocco della MAGL porta ad un abbassamento del livello di amminoacidi nel cervello in contrapposizione all’innalzamento del 2-AG, questo coincide anche con una riduzione della produzione di prostaglandine e trombossano nel cervello.
Tuttavia, un blocco della MAGL non porta ad un vero e proprio comportamento cannabinoide analogo a quello che si osserva attraverso l’uso di agonisti cannabinoidi diretti, i quali hanno come effetti, ad esempio, catalessia e ipotermia; ciononostante un blocco acuto con l’inibitore JZL 184 produce una modesta ipomotilità cannabinoide-mediata. Studi dimostrano che una cronica inibizione farmacologica conduce ad una perdita degli effetti cannabinoide-mediati con l’instaurazione di una tolleranza agli agonisti CB1; inoltre può insorgere una dipendenza fisica.
La MAGL è inoltre altamente espressa nelle cellule tumorali aggressive e nei tumori primari, dove regola i livelli di acidi grassi e delle molecole segnale protumorigeniche. La sovraespressione di MAGL nelle cellule tumorali meno aggressive causa un aumento dei livelli di acidi grassi e promuove la proliferazione cellulare e la crescita tumorale in vivo. Al contrario, il trattamento con un inibitore o il silenziamento dell’enzima in cellule tumorali aggressive porta ad una riduzione dell’attività idrolitica sui monogliceridi, dei livelli di acidi grassi e conseguentemente della loro patogenicità.
L’analisi western-blot sull’enzima estratto da diversi tessuti ha rivelato la presenza di isoforme con distinti pesi molecolari, compresi fra 30 kDa e 40 kDa.[3,4] È chiaro, quindi,
come, a seconda del tessuto e delle cellule in cui viene espressa, la MAGL possa avere un ruolo e una funzione diversa. A livello cerebrale essa controlla il segnale del 2-AG sul recettore CB1, nei tessuti periferici catalizza l’ultima fase della cascata che porta al rilascio di acidi grassi liberi a partire dalle riserve di trigliceridi, infine nelle cellule tumorali contribuisce al controllo dei livelli di acidi grassi liberi necessari per la sintesi dei messaggeri tumorali.[5]
1.3 Struttura della monoacilglicerolo lipasi
La MAGL fa parte della sottofamiglia delle lipide idrolasi, che insieme ad altre sottofamiglie (come estere idrolasi, peptide idrolasi, aloperossidasi e dealogenasi) popolano la più grande famiglia di α/β idrolasi. Tutti questi enzimi condividono una struttura comune chiamata ripiegamento delle α/β idrolasi, costituita da otto foglietti-β affiancati su entrambi i lati da α-eliche. Il ripiegamento è in grado di tollerare una vasta varietà di inserzioni, solitamente localizzate tra la catena β6 e l’elica α6, utili a modificare e regolare l’attività catalitica della proteina senza perdere le peculiarità che caratterizzano la famiglia di enzimi.
La struttura della MAGL presenta un ripiegamento molto affine a quello canonico delle α/β idrolasi. Sono presenti, però, proprio nella porzione di sequenza più soggetta a variabilità, due eliche addizionali che costituiscono un “coperchio” a protezione dell’accesso alla triade catalitica. Altre piccole idrolasi, a differenza della MAGL, hanno il sito catalitico
Figura 1. Struttura della MAGL. Gli amminoacidi della triade catalitica sono colorati
esposto al solvente. La triade catalitica della MAGL, la cui sequenza è stata identificata come Ser122-His269-Asp239, è stata individuata attraverso mutagenesi sito-diretta su MAGL purificata di ratto, portando all’evidenza di come questi tre amminoacidi fossero essenziali per l’attività dell’enzima.[6]
I tre residui amminoacidici giacciono sul fondo di una tasca a forma di tunnel (~25 Å in lunghezza e ~8 Å in larghezza) la cui entrata, esposta a solvente, è occupata dal dominio “coperchio”. Il fondo del tunnel è occluso, mentre la porzione apicale presenta uno sbocco rivolto verso la regione occupata dal solvente. In prossimità del termine del canale, e quindi della triade catalitica, vi è un piccolo foro, dal quale si suppone fuoriesca, in seguito all’idrolisi, il substrato endogeno. Nel complesso si può descrivere la tasca come un tunnel idrofobico largo e allungato con un’estremità polare, adatto ad accogliere molecole caratterizzate da lunghe catene alifatiche e testa polare, proprio come il ligando endogeno 2-arachidonoilglicerolo (2-AG).[7]
Il tunnel si può ritrovare in due diversi stati, chiuso o aperto, a seconda della conformazione assunta dal dominio “coperchio”. La forma chiusa di tale dominio è stata osservata in seguito a cristallizzazione con un inibitore reversibile dell’enzima (PDB ID: 3PE6), mentre la forma aperta è stata riportata in raggi X relativi all’enzima sia libero (PDB ID: 3HJU) che complessato con un inibitore irreversibile, il SAR 629 (PDB ID: 3JWE).
Sovrapponendo i raggi X della forma chiusa e della forma aperta si può osservare che
Figura 2. Cavità di legame dell’enzima ed inibitore irreversibile
quasi esclusivamente il dominio “coperchio”, e in particolare i residui 151-173, subiscono un riarrangiamento in seguito al legame con il ligando, mostrando quindi variazioni conformazionali significative. La transizione dalla forma aperta dell’enzima libero a quella chiusa dell’enzima complessato può essere descritta come un movimento rotazionale di circa 180º in senso antiorario dell’α-elica 4 attorno al sito attivo. L’effetto complessivo di questo avvolgimento verso l’interno è rappresentato da un accesso più ingombrato al sito attivo e dal blocco del composto all’interno della proteina. La piccola apertura localizzata nei pressi del sito attivo, che si è supposto fosse implicata nella fuoriuscita del substrato idrolizzato, è anch’essa completamente obliterata a causa del riarrangiamento strutturale.
1.4 MAGL e metabolismo lipidico
Il metabolismo lipidico è un processo altamente regolato, il cui scopo è il mantenimento del sottile equilibrio tra richiesta e domanda di acidi grassi. Essi vengono immagazzinati negli adipociti come triacilgliceroli sotto forma di gocce lipidiche, idrolizzati secondo necessità e immessi nel circolo sanguigno.[8] Gli acidi grassi sono essenziali come substrati
per la produzione di energia e per la sintesi di molecole lipidiche, le quali possono costituire lipidi di membrana e molecole segnale. La loro importanza è evidenziata dal fatto che tutti gli organismi sono in grado di produrne ex novo a partire da carboidrati o metaboliti proteici. Una situazione caratterizzata da un eccesso di acidi grassi risulta però essere particolarmente pericolosa, in quanto può portare ad un’alterazione nell’omeostasi acido-base delle cellule, alla distruzione dell’integrità delle membrane e alla formazione di pericolosi lipidi bioattivi. Nel complesso questi effetti negativi sono definiti come lipotossicità, e possono portare a stress del reticolo endoplasmatico, disfunzioni mitocondriali, infiammazione e morte cellulare.
Le cellule mantengono l’omeostasi in quanto sono in grado, attraverso esterificazione con glicerolo, di “detossificare” gli acidi grassi liberi, portando alla formazione di trigliceridi che possono essere immagazzinati nel tessuto adiposo, specializzato a questo scopo. La MAGL, insieme ad altri enzimi lipolitici, gioca un ruolo nel ramo catabolico del ciclo degli acidi grassi. L’idrolisi di triacilgliceroli in acidi grassi e glicerolo richiede tre passaggi con la rispettiva azione di tre enzimi principali: ATGL (triacilglicerol lipasi del tessuto adiposo) catalizza lo step iniziale della lipolisi, convertendo i triacilgliceroli in diacilgliceroli; HSL
(lipasi ormone sensibile) è responsabile principalmente dell’idrolisi dei diacilgliceroli in monoacilgliceroli; infine la MAGL si occupa di idrolizzare i monoacilgliceroli.
1.5 Implicazioni della MAGL nel Sistema
Endocannabinoide
Una delle funzioni essenziali dei recettori cannabinoidi e degli endocannabinoidi è di essere coinvolti nella plasticità sinaptica e di modulare il segnale mediato da altri trasmettitori. La depolarizzazione del neurone postsinaptico, così come quella dei recettori accoppiati a proteine Gq, porta all’attivazione della via biosintetica degli endocannabinoidi nel neurone postsinaptico. Gli endocannabinoidi appena sintetizzati attraversano lo spazio sinaptico e si legano ai recettori CB1 presinaptici inibendo l’influsso di calcio e diminuendo il rilascio di vescicole. Nel complesso, questa catena di eventi porta a una attenuazione degli effetti delle correnti inibitoria o eccitatoria sulle sinapsi GABAergiche e glutammatergiche rispettivamente.[9]
La MAGL interpreta un ruolo fondamentale nella deattivazione dell’endocannabinoide 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), un neuromessaggero che media le funzionalità di molte sinapsi. Il 2-AG possiede alcune caratteristiche degli endocannabinoidi: attiva i recettori cannabinoidi, è prodotto in modo attività-dipendente dai neuroni ed è eliminato rapidamente. Il 2-AG è un agonista completo del recettore centrale CB1 così come del recettore periferico CB2. Esso costituisce il prodotto principale della via della fosfolipasi-Cβ diacilglicerol lipasi, che inizia a partire dall’1-stearoil-2-arachidonoil-fosfatidilinositolo. Studi recenti hanno dimostrato che il 2-AG viene rilasciato dai neuroni postsinaptici in risposta alla depolarizzazione e alla stimolazione di recettori accoppiati a proteine Gq, attuando un controllo retrogrado negativo a livello sinaptico sui recettori CB1 presenti nei terminali presinaptici.[10] Il 2-AG è principalmente deattivato ad opera della MAGL attraverso l’idrolisi
in acido arachidonico e glicerolo.
Un altro endocannabinoide è l’anandamide, che è molto simile al 2-AG, da cui si differenzia solo per la presenza di un gruppo ammidico in sostituzione al gruppo estereo. L’anandamide viene idrolizzato ad opera dell’enzima FAAH (idrolasi dell’ammide dell’acido grasso) in acido arachidonico ed etanolammina. Al contrario del 2-AG esso è un agonista
parziale dei recettori CB1 e CB2. Negli ultimi anni si è assistito ad un aumento degli sforzi della ricerca scientifica per individuare inibitori specifici dei due enzimi, non solo per l’utilità nel controllo dei livelli endogeni di endocannabinoidi, ma anche come potenziali agenti terapeutici per condizioni quali dolore, infiammazione, ansia, e cancro. Ottenere un inibitore selettivo della MAGL rispetto alla FAAH potrebbe essere utile a distinguere i ruoli dei due endocannabinoidi. Raggiungere questa selettività non è però facile a causa del comune meccanismo catalitico ai due enzimi, basato su una serina nucleofila, e della similarità strutturale tra i due substrati.[11]
1.6 Potenzialità terapeutiche dell’enzima MAGL
Sono state ipotizzate delle potenzialità terapeutiche della MAGL principalmente dipendenti dall’azione sul sistema endocannabinoide.
✔ Dolore e infiammazione ✔ Malattie neurodegenerative ✔ Ansia
✔ Dipendenza
Gli agonisti dei recettori cannabinoidi sono attualmente usati per trattare dolore, spasticità, nausea e anoressia. In aggiunta a queste applicazioni cliniche, è stata rilevata un’azione anti-nocicettiva ed anti-infiammatoria degli agonisti dei recettori CB1 e CB2.[12] I FANS, come
l’aspirina o l’ibuprofene, sono ampiamente usati nel trattamento di dolore, febbre e infiammazione. Essi agiscono attraverso il blocco delle cicloossigenasi (1 e 2) con conseguente riduzione dei livelli di prostaglandine e trombossani responsabili dell’infiammazione. La MAGL, a sua volta, controlla la formazione dell’acido arachidonico, molecola precursore nella produzione di prostaglandine e trombossani, portando quindi al medesimo effetto antinfiammatorio. Inoltre dato il ruolo di controllo sull’endocannabinoide 2-AG, il blocco della MAGL si accompagna ad un effetto antinocicettivo CB1 dipendente.[13] [14]
Oltre alle implicazioni nella nocicezione e nella neuroinfiammazione la MAGL è ora considerata coinvolta in più malattie neurodegenerative come il Parkinson, l’Alzheimer, la sclerosi multipla e l’ictus.[15] Sia gli agonisti al recettore cannabinoide che gli inibitori COX
Gli agonisti selettivi CB2 e non selettivi CB1/CB2 mostrano, in modelli animali di Parkinson, un’azione che incrementa la sopravvivenza di neuroni e fibre dopaminergiche, riduce la deplezione di dopamina nella sostanza nigra e aumenta l’attività della NAPDH ossidasi verso le riduzioni.[18][19] E’ stato sperimentato che in un modello di topo a cui è stato
provocato l’Alzheimer, gli agonisti del recettore cannabinoide riducono l’attivazione microgliale, i livelli di TNFα, l’espressione di COX2 e i livelli di placche amiloidi β.
Gli inibitori della MAGL esibiscono effetti antinocicettivi ed antiinfiammatori attraverso la simultanea attivazione del sistema endocannabinoide e la soppressione dei livelli di eicosanoidi nel cervello. Poiché il blocco cronico di MAGL porta alla desensitizzazione funzionale del sistema endocannabinoide, l’attività antineuroinfiammatoria finale è dovuta esclusivamente al blocco della sintesi degli eicosanoidi.[20]
La MAGL sembra avere inoltre una possibile applicazione nel trattamento dell’ansia. Il blocco della MAGL previene lo stress cronico indotto e la depressione legata alla trasmissione GABAergica, ciò indica che l’aumentato segnale endocannabinoide previene comportamenti e adattamenti sinaptici allo stress cronico che porterebbero allo sviluppo di peggioramenti nei disordini affettivi. Pertanto, complessivamente, gli inibitori MAGL promettono una riduzione dell’ansia.[21]
È stato provato come il sistema endocannabinoide moduli la dipendenza da droghe.[22]
Sia l’agonista del recettore cannabinoide Δ9-tetraidrocannabinolo che il blocco della MAGL
riducono l’intensità dell’astinenza da morfina nel topo, in maniera CB1 dipendente. Dietro i comportamenti finalizzati alla ricerca di droga sembra esserci un potenziale meccanismo cellulare interconnesso tra sistema cannabinoide, dopaminergico e glutamatergico. Il blocco della MAGL influenza la risposta recettoriale dei recettori dopaminergici D1 e D2 agli agonisti. Nel complesso, gli inibitori MAGL, potrebbero essere utili per modulare la dipendenza da oppiacei e THC.[23]
1.7 Ruolo della MAGL nel cancro e strategie terapeutiche
Nel paragrafo 1.6 è stata descritta l’implicazione della MAGL nel sistema cannabinoide, tale sistema è essenziale in varie regioni del cervello incluso ipotalamo, cervelletto, ippocampo, striato, neocorteccia, dove il fine sembra essere quello di provvedere a risposte protettive/omeostatiche allo stress e di regolare processi affettivi, cognitivi e motivazionali.
[24] Oltre che nel sistema nervoso centrale, è anche importante a livello periferico, dove
controlla numerose funzioni biologiche come la nocicezione, il metabolismo, la riproduzione e alcune funzionalità cardiovascolari e gastrointestinali. È stata recentemente dimostrata l’implicazione della MAGL nella patogenesi del cancro, facendo sperare nello sviluppo di farmaci antitumorali basati sulla sua inibizione.[25]
Il segnale dei mediatori lipidici locali sembra giocare un ruolo in molte condizioni patologiche. Ad esempio la prostaglandina E2 induce proliferazione cellulare, migrazione e favorisce la crescita tumorale, l’angiogenesi e la metastasi in modelli animali di cancro. L’attivazione del recettore cannabinoide, provoca l’effetto opposto nella maggior parte dei contesti cellulari.
La monoacilglicerolo lipasi, oltre a mediare il segnale endocannabinoide del 2-AG, è coinvolta nella distruzione delle riserve adipose di triacilgliceroli, in modo da garantire ai tessuti il fabbisogno di acidi grassi liberi, quindi assume un ruolo delicato nell’omeostasi metabolica in particolare nei periodi di carenza di glucosio.
L’interesse della MAGL come target farmacologico è basato sulle due diverse implicazioni dell’enzima:
• Controllo del rilascio di acidi grassi dalle riserve lipidiche nelle cellule cancerose, dove garantisce la presenza di acidi grassi liberi necessari per la produzione dei segnali lipidici, che promuovono la crescita tumorale;
• Deattivazione dell’endocannabinoide 2-arachidonoilglicerolo, neurotrasmettitore che regola la funzionalità e la plasticità di numerose sinapsi.
I tumori umani sono altamente eterogenei in termini di richiesta di nutrienti, ossigenazione e sviluppo di progressive alterazioni negli stati energetici e proliferativi, come ad esempio nel caso del distretto vascolare. La riprogrammazione del metabolismo energetico che avviene nelle cellule tumorali può essere giustamente incluso fra le caratteristiche tipiche del cancro. Tra le vie metaboliche sregolate correlate a malignità tumorale, lo spostamento dal metabolismo ossidativo del glucosio alla glicolisi diretta dall’acido lattico, è l’esempio più rappresentativo e documentato. Oltre a questo, le cellule tumorali richiedono processi anabolici per aumentare la sintesi di proteine, acidi grassi e lipidi.
Le cellule tumorali adattano il loro metabolismo attraverso lo sviluppo di un fenotipo lipogenico, caratterizzato da sintesi ex novo di acidi grassi, che è strettamente correlato con l'elevata espressione della MAGL. Queste caratteristiche delle cellule cancerose favoriscono la crescita tumorale in modelli animali e sono correlate a una prognosi infausta in vari tipi di tumori umani.[26]
L’aumentata lipogenesi, almeno razionalmente, sembra contribuire alla crescita tumorale attraverso più meccanismi come la generazione di substrati energetici e la costruzione dei
precursori di membrane cellulari o di lipidi oncogenici. Appena sintetizzati gli acidi grassi sono rapidamente incorporati nelle riserve lipidiche cellulari; si pensa che le cellule cancerose possano possedere una via lipolitica complementare atta a sfruttare la struttura acilica di queste riserve per generare molecole segnale.[25] Nomura e al. (2010) hanno notato,
attraverso un approccio proteomico, che tra le molte serina idrolasi prese in considerazione, la MAGL risulta altamente espressa in linee cellulari aggressive piuttosto che non aggressive, occupandosi della massiccia deplezione di monoacilgliceroli per incrementare il livelli di acidi grassi liberi nelle cellule aggressive. L'attività della MAGL risulta inoltre correlata all'elevata proliferazione, all'invasività ed alla crescita tumorale in vivo e ciò è stato dimostrato dal fatto che il blocco genetico o farmacologico di MAGL in cellule aggressive le rende meno ricche in acidi grassi e meno maligne; al contrario, l’espressione ectopica di MAGL in cellule non aggressive le arricchisce in acidi grassi e le rende più maligne.
Sono state riportate evidenze sperimentali a favore della tesi che la MAGL supporti le proprietà maligne delle cellule cancerose mantenendo elevati i livelli di acidi grassi, a loro volta implicati nella produzione di vari messaggeri, come PGE2 e LPA, piuttosto che nella β-ossidazione, nella glicolisi, o nella generazione di membrane lipidiche, almeno nelle cellule testate.
1.8 Meccanismo catalitico
Il meccanismo catalitico della MAGL coinvolge la triade Ser122-His269-Asp239.[27] La
Figura 4. Pathways degli effetti antitumorali attraverso l'utilizzo di agonisti cannabinoidi nel cancro.
Figura 5. Attività catalitica della MAGL sul substrato 2-AG
O O OH OH HO O N Ser122 OH OH OH O O N O HO O H2O
nucleofilicità della serina deriva dalla partecipazione alla triade catalitica.[28][29] Il
meccanismo catalitico procede attraverso la formazione di un intermedio acil-enzima in cui è implicata la serina del sito attivo, seguita da una saponificazione del prodotto indotta dall’acqua con rigenerazione del residuo libero di serina che può rientrare nel successivo ciclo catalitico.[30][31]
1.9 Inibitori della MAGL
I primi inibitori della MAGL sono stati descritti circa quarant’anni fa e comprendono composti quali il p-cloromercuriobenzoato, il cloruro di mercurio e la N-etilmaleimide (NEM). Questi composti sono in grado di reagire con gruppi sulfidrilici, pertanto, basandosi sul potenziale inibitorio riconosciuto al NEM e su un modello tridimensionale di MAGL, che mostra la presenza di due cisteine (Cys208 e Cys242) nel sito attivo, sono stati sintetizzati una serie di derivati maleimidici il cui meccanismo di inibizione coinvolge una addizione di Michael su uno o su entrambi i residui sulfidrilici.
Il composto più potente, con un IC50 di 0.14 μM, che
presenta questo scaffold, è l’N-arachidonoilmaleimide (NAM).[32]
Studi effettuati allo scopo di chiarire il meccanismo di inibizione enzimatica di questi derivati hanno confermato che il doppio legame olefinico presente sullo scaffold maleimidico è altamente suscettibile di attacco nucleofilo da parte di gruppi sulfidrilici. In particolare il meccanismo di interazione è stato individuato in un'addizione di Michael, in quanto analoghi saturi della maleimide (es. succinimmide), incapaci di comportarsi da accettori di Michael, hanno un'attività inibitoria decisamente inferiore. A seguito dell'inibizione con i derivati maleimidici, l'attività dell'enzima non può essere ripristinata e ciò sta ad indicare una modifica covalente della monoacilglicerolo lipasi. L'inibizione della MAGL ad opera delle maleimidi può essere dovuta o ad un ingombro sterico o ad un cambiamento conformazionale dell'enzima. Il fatto che l'attività della MAGL non sia completamente abolita può essere spiegato facendo riferimento al meccanismo d'inibizione, poiché le maleimidi si legano ad una cisteina localizzata vicino alla triade
Figura 6.
N-arachidonoilmaleimide
N O
catalitica e non ai residui della triade catalitica stessa. Partendo dalle osservazioni fatte per la NAM, sono stati sintetizzati vari derivati N-fenilmaleimidici. In particolare i composti più promettenti sono l'1-bifenil-4-metilmaleimide, in cui fra l'anello maleimidico e la porzione bifenilica c'è uno spaziatore metilenico e l'1,4-bis-(maleimido)xylene, che ha una struttura bis-maleimidica. Entrambi questi composti hanno un IC50 nel basso micromolare.[33]
Uno dei primi inibitori irreversibili riportati in letteratura è AM 6701,[34] che presenta un IC
50 di 0.9 nM nei confronti
della monoacilglicerolo lipasi umana. Attraverso studi di spettrometria di massa e analisi mutazionale è stato visto che il suo meccanismo di inibizione è legato ad una reazione di carbamoilazione sulla Ser122 catalitica.
Un altro inibitore che esercita la sua azione interagendo con la serina catalitica della MAGL è CAY 10499,[35] un composto a struttura carbammica
che inibisce irreversibilmente l'enzima con un IC50
nell'ordine del nanomolare. Studi ulteriori su questo
composto hanno dimostrato che esso è un buon inibitore anche della FAAH, un altro enzima coinvolto nel sistema endocannabinoide.
Anche derivati a struttura bis(dialchhilamminotiocarbonil) disolfurica[36] sono stati descritti come inibitori irreversibili
della MAGL. Tali composti, il più rappresentativo dei quali è riportato nella figura 10, esercitano la loro attività
Figura 10. Derivato bis(dialchhilamminotiocarbonil) disolfuro N N S S S S N N Figura 9. CAY 10499 O N H O N N O O O Figura 8. AM 6701 N N N N O N
Figura 7. Strutture del 1-bifenil-4-metilmaleimide (sinistra) e
1-bifenil-4-metilmaleimide (destra) N O O N O O N O O
inibitoria mediante l'interazione con i residui Cys208 e Cys242 presenti nelle vicinanze del sito attivo.
Nel tentativo di caratterizzare ulteriormente il ruolo dei residui di cisteina della MAGL è stata identificata una nuova famiglia di potenti inibitori enzimatici a struttura isotiazolinonica. Fra queste molecole, il 2-octil-4-isotiazolin-3-one è quello che mostra il profilo più interessante in quanto è in grado di legarsi
covalentemente alla Cys208, inibendo la MAGL in vitro con un IC50 di 88 nM.[37]
SAR 629 è un derivato appartenente alla serie delle triazolocarbossammidi che mostra un'attività nel range del nM. Esso è un inibitore irreversibile che si lega covalentemente con la serina catalitica 122; tuttavia tale legame non sembra essere completamente irreversibile perché si suppone che una molecola d'acqua sia in grado di idrolizzare la funzione carbamato che collega la serina catalitica e l'inibitore, ma questo processo sembra essere molto lento ed è per questo
motivo che SAR 629 è considerato irreversibile.[38]
Un altro composto che inibisce con elevata potenza la MAGL umana (IC50 < 0.4 nM) è JJKK 048, il quale si lega alla Ser122
formando un addotto carbammico grazie alla presenza del triazolo che si comporta da gruppo uscente.[39]
Lo stesso meccanismo d'azione di carbamoilazione sulla Ser122 è stato dimostrato per il composto AM 6580, che è un
inibitore irreversibile in quanto causa un'alterazione permanente sulla conformazione della monoacilglicerolo lipasi.[40]
Altri potenti inibitori covalenti che formano un legame con il residuo della serina catalitica sono JZL 184 (IC50 = 8 nM) e
Ly 2183240 (IC50 = 20 nM) ma entrambi mancano di
selettività.[41] Figura 11. 2-octil-4-isotiazolin-3-one N S O Figura 12. SAR 629 F F N N O N N N Figura 13. JJKK 048 O O N O N O O N N Figura 14. AM 6580 N N N N N O N
Allo scopo di aumentare la selettività nei confronti della monoacilglicerolo lipasi sono stati sintetizzati
composti che portano un gruppo benzidrilico sulla posizione 4 della piperazina. In particolare il composto ML 30, che presenta un elevato ingombro sterico a causa del sostituente difenilmetilico, presenta una potenza dieci volte maggiore sulla MAGL (IC50 = 0.50 nM) e un'importante diminuzione
dell'attività inibitoria sulla FAAH.[42]
Infine, CK 37 è una molecola appartenente alla classe dei dinitroarilditiocarbamati che è stata recentemente sintetizzata ed identificata come inibitore irreversibile della MAGL. La sua attività prevede l'interazione con gli amminoacidi cisteina 208 e
242 e
probabilmente ciò porta alla formazione di ponti disolfuro che inattivano la MAGL.[43]
Pertanto in letteratura sono stati descritti diversi inibitori irreversibili dell'enzima MAGL caratterizzati da scaffold di natura diversa. Molti di questi inibiscono l'enzima formando un legame covalente con la serina della triade catalitica, ma ci sono anche dei composti promettenti che esplicano il loro meccanismo d'azione interagendo con due residui di cisteina localizzati in prossimità del sito attivo. In questo secondo caso l'inibizione non è tanto dovuta ad un blocco dell'attività catalitica dell'enzima quanto ad un cambiamento conformazionale della MAGL. Risulta quindi interessante la ricerca e lo sviluppo di nuovi potenziali inibitori che agiscano legandosi covalentemente alla cisteina e che presentino sostituenti opportuni al fine di massimizzare l'interazione con gli amminoacidi presenti nel sito attivo della MAGL.
Figura 16. ML 30 N N N O N N Figura 17. CK 37 S S N N O2N NO2
Figura 15. Strutture di Ly 2183240 (sinistra) e JZL 184 (destra)
O N O OH NO2 N N N N N O O O O O
2. Sintesi:
Risultati e Discussione
2.1 Introduzione alla parte sperimentale
La parte relativa alla sintesi di questo progetto di tesi è rivolta all'ottenimento di composti con struttura generale benziliden-ossazol-5-onica (Figura 18).
Queste strutture, già precedentemente sintetizzate dallo stesso gruppo di ricerca del Prof. Minutolo, erano state progettate in prima battuta come inibitori dell'enzima lattato deidrogenasi (LDH). Tuttavia, lo scaffold benziliden-ossazolonico risultava interessante anche per una potenziale attività inibitoria nei confronti dell'enzima monoacilglicerolo lipasi (MAGL), in quanto era stato osservato che tale struttura aveva delle caratteristiche in comune con alcuni inibitori irreversibili dell'enzima MAGL già descritti in letteratura (vedi cap 1.9); in particolare, erano state osservate delle analogie con l'inibitore a struttura carbammica CAY 10499. Inizialmente il composto CAY 10499 era stato studiato come inibitore dell'enzima Hormone-Sensitive Lipase (HSL, lipasi ormone sensibile). Studi hanno dimostrato che nel caso del CAY 10499, è il ciclo ossadiazolonico (porzione 5-metossi-1,3,4-ossadiazol-2(3H)-onica) a rendersi protagonista della formazione di un legame covalente con la serina catalitica dell'enzima HSL, a seguito del quale si ha l'apertura del ciclo dell'inibitore e di conseguenza una modifica conformazionale irreversibile a carico dell'enzima.[44] Perciò è stato ipotizzato che tale composto potesse inibire anche l'enzima
MAGL (e anche l'altro enzima coinvolto nel catabolismo degli endocannabinoidi, la FAAH) per mezzo di un'interazione fra la serina catalitica dell'enzima e la porzione carbammica. Infatti i carbammati sono noti per interagire con numerosi enzimi, inclusi vari enzimi del sistema endocannabinoide. Sulla base di questi conoscenze pregresse, era stato pertanto ipotizzato che il ciclo ossazol-5-onico potesse altrettanto efficacemente interagire con la monoacilglicerolo lipasi mediante apertura dell'anello e conseguente formazione di un
Figura 18. Struttura generale benziliden-ossazol-5-onica R N O O CH3
legame covalente.
A dimostrazione della validità di tale ipotesi, lo screening effettuato in parallelo per valutare l'attività inibitoria del composto sintetizzato CG 231 sia sull'enzima LDH che sulla MAGL ha indicato una bassa affinità per LDH, ma una promettente attività (nell'ordine del basso micromolare) sulla MAGL.
Una prima conferma dell'importanza del nucleo ossazolonico per l'attività sulla MAGL è stata fornita dalla sintesi e dalla successiva valutazione biologica del composto CG 234, nel quale è stata mantenuta la porzione bifenilica ma si è avuta l'apertura del ciclo ossazolonico; preliminari saggi di inibizione enzimatica su questa molecola hanno mostrato un abbattimento significativo dell'attività rispetto al composto precedentemente descritto.
Le strutture cristallografiche attualmente disponibili della MAGL hanno fornito interessanti informazioni riguardo la conformazione del sito attivo dell'enzima; in particolare esso è caratterizzato dalla presenza di un largo ed allungato tunnel idrofobico con un fondo polare e tale topologia ben si accorda con la struttura del substrato endogeno 2-AG, che presenta una lunga e flessibile catena alifatica che termina con una testa polare. Le molecole a strutture benziliden-ossazolonica soddisfano questo requisito strutturale, in quanto ad una porzione polare, costituita dal ciclo ossazolonico, è legata una porzione idrofobica.
Figura 19. Struttura derivato
CG-231
N O
O
CH3
Figura 20. Struttura derivato
CG-234
HN
COOH O CH3
Inoltre è stato dimostrato che, rispetto alla FAAH, la MAGL presenta un sito catalitico più ampio e ciò suggerisce che l'aggiunta di altri anelli aromatici allo scaffold benziliden-ossazol-5-onico possa determinare un aumento della selettività nei confronti della monoacilglicerolo lipasi. Lo stesso composto CG 231 rappresenta un prova significativa di tale ipotesi, in quanto la porzione bis-arilica risulta fondamentale per avere una maggiore attività inibitoria.
Sulla base di queste conoscenze pregresse, lo scopo di questa parte della mia tesi è stato quello di sintetizzare molecole a struttura benziliden-ossazolonica, introducendo diversi tipi di sostituenti, allo scopo di individuare composti con attività inibitoria di tipo irreversibile nei confronti della MAGL. L'inibizione di questo enzima rappresenta infatti un interessante target terapeutico per il trattamento di numerose patologie; in particolare, i composti progettati nel gruppo di ricerca dove ho svolto la mia tesi appartengono alla classe degli inibitori irreversibili in quanto si legano covalentemente alla MAGL, determinando così una sua inattivazione duratura nel tempo.
2.2 Schema generale di sintesi
La procedura sintetica utilizzata allo scopo di ottenere il motivo strutturale benziliden-ossazolonico che, come descritto nel capitolo 2.1, rappresenta un promettente scaffold di inibitori irreversibili della MAGL, è la seguente, illustrata nello Schema 1:
La sintesi prevede l'utilizzo di substrati aldeidici variamente sostituiti, disponibili commercialmente o facilmente ottenibili attraverso reazioni di cross-coupling. Questi substrati, vengono fatte reagire con N-acetilglicina, anidride acetica e acetato di sodio in un pallone di reazione scaldando a 100 °C a riflusso per 4-5 ore. Infine, la reazione viene fatta raffreddare a temperatura ambiente lasciandola a riposo per tutta la notte.[45]
Schema 1. Reazione generale di formazione del nucleo benziliden-ossazol-5-onico.
R N O O CH3 O NH O OH O H R Ac2O AcONa (1 eq.) 100 °C Reflux 1 eq. 1 eq.
Il meccanismo di reazione per la formazione del prodotto desiderato prevede una iniziale ciclizzazione intramolecolare della N-acetilglicina in anidride acetica, che porta alla formazione della struttura ossazolonica. Successivamente, la deprotonazione in presenza di base di uno dei protoni metilenici determina la formazione di una specie nucleofila che attacca il carbonile aldeidico. L'addotto, tramite il calore fornito alla reazione perde facilmente acqua formando il prodotto finale in cui è presente una estesa coniugazione (Schema 2).
2.3 Procedure Sintetiche
2.3.1 Tentativo di sintesi con microonde
Alcuni dati riportati in letteratura indicano che la sintesi del nucleo ossazol-5-onico
Schema 2. Meccanismo di formazione del ciclo ossazolonico
Schema 3. Prova sintetica alle condizioni di microonde
OH O HN H H O Ac2O -H2O N O O H H H O -H2O Heat N O O R R Ac2O N O O H N O O R OH H Ac2O Ac2O AcONa N O O CH3 CHO O NH O OH Ac2O AcONa 100 °C Reflux 3 1 2
avviene efficacemente e con rese elevate sfruttando l'energia delle microonde al posto della più classica energia termica. Questo consente un notevole risparmio di tempo, riducendo i tempi di reazione da 4-5 ore a soli 4 minuti.[46][47] Sulla base di ciò, in primo luogo abbiamo
cercato di riprodurre le condizioni di reazione con le microonde utilizzando i due strumenti a nostra disposizione, ovvero il MW-CEM e il MW-Biotage (Schema 3).
All'interno di una fiala per microonde, il prodotto commerciale benzaldeide è stato solubilizzato in Ac2O ed alla miscela di reazione risultante sono state aggiunte la
N-acetilglicina e l'AcONa. Ad ogni strumento sono stati impostati i parametri necessari per definire il ciclo di reazione; per quanto riguarda il MW-CEM i parametri utilizzati sono:
• Tempo per raggiungere le condizioni di reazione: 1 minuto; • Tempo di reazione: 4 minuti;
• Pressione: 0 psi; • Temperatura: 100 °C; • Potenza: 300 W.
Tuttavia, durante il ciclo di reazione lo strumento non ha raggiunto la pressione,la temperatura e la potenza impostate. Al termine del ciclo di reazione, la TLC analitica presentava solamente la macchia relativa al prodotto di partenza.
Nel caso del MW-Biotage, sono stati invece impostati i seguenti parametri, necessari per definire il ciclo di reazione della durata complessiva di 4 minuti:
• Pressione: 0 bar; • Potenza: 300 W • Temperatura: 100 °C
Dopo questo primo ciclo di reazione, in cui non si è mai raggiunto il parametro di potenza prefissato, è stata effettuata una TLC analitica, che ha mostrato una macchia di debole intensità con Rf diverso rispetto a quello del prodotto di partenza. Abbiamo così eseguito due ulteriori cicli di reazioni al MW-Biotage: il secondo ciclo differiva dal primo solo per l'impostazione della temperatura a 50 °C, mentre il terzo ciclo per la condizione di pressione impostata a 20 bar. Tuttavia, sia nel secondo che nel terzo ciclo non si sono raggiunte le condizioni impostate allo strumento. La TLC analitica eseguita sul grezzo di reazione ha mostrato una regressione della macchia precedentemente osservata, pertanto si è deciso di non procedere con la purificazione.
2.3.2 Sintesi in condizioni termiche dei composti 3, 5, 7 e 10
Data la non efficacia della sintesi al microonde, siamo passati alle classiche condizioni termiche già precedentemente descritte al capitolo 2.2. In primo luogo ci siamo concentrati sull'ottenimento di prodotti partendo da aldeidi reperibili commercialmente.
Il prodotto commerciale benzaldeide, sottoposto a reazione di formazione del ciclo ossazolonico, ha mostrato la formazione del prodotto desiderato con una resa del 47% (Schema 4).[45]
Quando la procedura sintetica è stata applicata sui derivati commerciali cicloesancarbossialdeide e 2-furaldeide si è avuto un risultato diverso rispetto a quello aspettato; in particolare l'analisi 1H NMR ha indicato che si è ottenuta in entrambi i casi la
miscela dei due isomeri cis/trans.[48]
La resa della reazione sulla cicloesancarbossialdeide è stata del 15%; dall'analisi delle costanti di accoppiamento Jcis e Jtrans ricavate dallo spettro 1H NMR abbiamo stabilito un
rapporto 5a/5b 59:41 (Schema 5).
Analogamente al caso precedente la reazione di ciclizzazione sulla 2-furaldeide ha portato ad ottenere una miscela degli isomeri cis/trans 7a/7b in rapporto 91:9, con una resa complessiva del 49% (Schema 6).
Schema 4. Sintesi del prodotto a partire dalla benzaldeide
Schema 5. Sintesi del prodotto a partite dalla cicloesancarbossialdeide
N O O CH3 CHO O NH O OH Ac2O AcONa 100 °C Reflux 3 1 2 CHO N O O CH3 H Ac2O AcONa 100 °C Reflux O NH O OH H N O O CH3 (Z) 5a (E) 5b 2 4
Successivamente abbiamo cercato di applicare la classica strategia sintetica sul prodotto commerciale pirrol-2-carbaldeide. L'analisi dello spettro 1H NMR ha mostrato però
l'ottenimento del solo prodotto di acetilazione sull'azoto pirrolico. Allo scopo di confermare l'ottenimento del solo prodotto acetilato, abbiamo sottoposto la 2-pirrol-carbaldeide ad una reazione di acetilazione in presenza di Ac2O e AcONa a 100 °C a riflusso. In questo modo,
confrontando gli spettri 1H NMR dei prodotti delle due reazioni, si è avuta la conferma
dell'ottenimento del solo composto 9. Questo è stato poi sottoposto alla classica reazione di condensazione per l'ottenimento del ciclo ossazolonico; ma analogamente a quanto accaduto per i composti 5a, 5b e 7a, 7b, il prodotto è stato ottenuto in miscela dei due isomeri
10a/10b in rapporto 94:6 (Schema 7).
Il nostro interesse si è poi spostato verso la sintesi di composti che potessero aiutarci, una volta valutata la loro attività sulla MAGL, a razionalizzare il loro potenziale meccanismo
Schema 6. Sintesi del prodotto a partite dalla 2-furaldeide
Schema 7. Sintesi a partire dalla pirrol-2-carbaldeide
Ac2O AcONa 100 °C Reflux O NH O OH O N O O CH3 O CHO H N O O CH3 H O (E) 7b (Z) 7a 6 2 N O CH3 N O O CH3 N CHO H Ac2O AcONa 100 °C Reflux N CHO O CH3 Ac2O AcONa 100 °C Reflux O NH O OH 9 (Z) 10a H N O H3C N O O CH3 (E) 10b H 2 8
d'inibizione sull'enzima. Infatti due sono i motivi strutturali di maggior rilievo per l'interazione con la MAGL: il sistema α,β-insaturo formato dal doppio legame e dal carbonile del nucleo ossazolonico, che può comportarsi da accettore di Michael in reazioni con nucleofili (ad esempio gruppi -SH o -OH di residui amminoacidici), e lo stesso ciclo ossazolonico che può aprirsi, a seguito dell'attacco di nucleofili sul carbonio carbonilico, formando un legame covalente (Schema 8):
Schema 8. Meccanismi ipotetici di interazione dello scaffold benziliden ossazolonico con la MAGL; in rosso è riportata
l'addizione di Michael mentre in blu è evidenziata l'apertura del ciclo ossazolonico
R N O O CH3 HX R N O O CH3 O H XH X = O,S R N O O H3C O H R N O O H3C OH R NH O O H3C O R N O O CH3 XH R N O O CH3 X R N O OH CH3 X
In particolare, per verificare quale delle due teorie fosse la più plausibile, era interessante valutare se la presenza di un gruppo elettron-attrattore (EWG) sull'anello benzenico del nucleo benziliden-ossazolonico andasse ad aumentare l'attività inibitoria di questi derivati. Per questo motivo, l'obiettivo era la sintesi del benziliden-ossazolone recante un gruppo nitro nella posizione para; il gruppo nitro è fortemente elettron-attrattore (circa due volte di più rispetto al gruppo carbonilico), pertanto diminuisce la densità elettronica sull'anello aromatico e sul doppio legame benzilidenico. Questo rende tale doppio legame più elettron-povero e quindi maggiormente suscettibile di addizione nucleofila. Di conseguenza, se il legame covalente fra la MAGL e il nucleo benziliden-ossazolonico si formasse attraverso un'addizione di Michael, il derivato p-nitro-sostituito dovrebbe avere una maggiore attività.
Per sintetizzare questo composto si è partiti dalla 4-nitrobenzaldeide che è stata sottoposta alle classiche condizioni di reazione per l'ottenimento del nucleo ossazolonico. Dall'analisi 1H NMR del grezzo di reazione, erano stati individuati alcuni segnali relativi al
possibile prodotto desiderato in miscela con il prodotto di partenza. Per questo motivo, una parte del grezzo è stata sottoposta a reazione con la resina PS-TsNHNH2, in THF anidro, per
cercare di eliminare l'aldeide. La resina PS-TsNHNH2 è un polimero a base di gruppi sulfonil
idrazinici, la cui capacità minima è di 2.2 mmoli/g; per ogni equivalente di starting material sono stati utilizzati 3.0 equivalenti di resina, la quale reagisce con l'aldeide permettendone l'allontanamento dalla miscela per semplice filtrazione. Tuttavia a seguito della purificazione, l'analisi degli spettri 1H NMR non ha mostrato l'ottenimento del prodotto
desiderato. Questo, probabilmente, può essere imputabile alla spiccata reattività dello stesso nitroderivato, che pertanto non risulta essere stabile alle condizioni in cui viene eseguita la colonna e non può essere purificato per mezzo di una flash cromatografia tradizionale (Schema 9).
Un ulteriore aspetto che meritava approfondimento era la valutazione dell'attività di composti che avessero un atomo spaziatore tra la porzione benzenica e la restante porzione di molecola. Questa considerazione si basava sulla ricerca di possibili miglioramenti nell'interazione tra questo tipo di derivati e il sito di legame con il recettore. Per questo motivo, il prodotto commerciale fenilacetaldeide è stato sottoposto alle classiche condizioni di formazione del ciclo ossazol-5-onico.[45] L'analisi 1H NMR effettuata sul prodotto ottenuto
per purificazione del grezzo di reazione ha mostrato però l'ottenimento di una miscela complessa di difficile interpretazione (Schema 10).
2.3.3 Sintesi in condizioni termiche del composto 15
Per cercare di comprendere se il meccanismo di interazione di questi composti fosse legato ad una addizione di Michael sul sistema α,β-insaturo, risultava interessante sintetizzare un derivato con il doppio legame tetrasostituito.
Inizialmente abbiamo pensato di usare le stesse condizioni utilizzate per le aldeidi, usando però come starting material il prodotto commerciale acetofenone; tuttavia, a seguito della reazione con N-acetilglicina, Ac2O e AcONa, la TLC analitica eseguita sul grezzo di
Schema 9. Tentativo di formazione del ciclo ossazolonico sulla 4-nitrobenzaldeide
Schema 10. Tentativo di sintesi a partire dalla fenilacetaldeide
CHO Ac2O AcONa 100 °C Reflux O NH O OH Nessuna Reazione 2 13 CHO O2N Ac2O AcONa 100 °C Reflux O NH O OH CHO O2N NO2 N O O CH3 S NHNH2 O O Dry THF Prodotto instabile, non isolabile 11 2 11 12
reazione ha mostrato solamente macchie relative allo starting material, confermandoci che la reazione non era avvenuta (Schema 11).[45]
In letteratura è stato riportato recentemente che l'uso della base ossalato d'ammonio monoidrato al posto dell'acetato di sodio poteva favorire la formazione del ciclo ossazol-5-onico sui chetoni. Il prodotto di partenza acetofenone è stato quindi sottoposto a reazione nelle medesime condizioni, con l'unica differenza della base utilizzata.[45][49] La TLC analitica
eseguita sulla miscela di reazione una volta raffreddata a temperatura ambiente ha mostrato però l'insuccesso di questa reazione (Schema 12).
In letteratura è riportata una procedura leggermente diversa per ottenere la formazione del ciclo ossazolonico su substrati chetonici; le condizioni descritte sono pertanto state applicate al substrato acetofenone, il quale, sotto flusso di N2, è stato solubilizzato in Ac2O e
successivamente trattato con N-acetilglicina, THF anidro e Pb(IV) acetato anidro come base.[50]
La miscela di reazione risultante è stata scaldata a riflusso per 24 ore.
In parallelo è stata condotta un'altra reazione, usando sempre gli stessi reattivi ma modificando la procedura: in particolare, in questo caso l'N-acetilglicina è stato solubilizzata in Ac2O e la soluzione risultante è stata lasciata in agitazione a 50 °C per 15 minuti;
dopodichè è stata aggiunta la base Pb(IV) acetato anidro e l'acetofenone solubilizzato in THF
anidro. La reazione è stata condotta a reflusso per 24 ore a 90 °C.
Schema 11. Tentativo di sintesi a partire da acetofenone tramite le classiche condizioni
termiche
Schema 12. Tenativo di ciclizzazione sul substrato acetofenone attraverso l'utilizzo della base ossalato
d'ammonio monoidrato O O NH O OH Ac2O AcONa 100 °C Reflux Nessuna reazione (SM) 14 2 O O NH O
OH Ossalato d'ammonio monoidrato
100 °C Reflux
Nessuna reazione (SM) Ac2O
L'analisi 1H NMR, effettuata sui prodotti ottenuti per purificazione dai grezzi di reazione,
ci hanno mostrato per quanto riguarda il primo tentativo l'isolamento dello starting material acetofenone, mentre per il secondo l'ottenimento di una miscela di prodotti non identificati, che non rappresentano il prodotto desiderato (Schema 13).
In ultima analisi, l'ultimo tentativo eseguito allo scopo di introdurre un metile sul doppio legame, è stato quello di provare a trattare il composto 3 precedentemente sintetizzato con l'agente metilante TMS-CH2N2, in Et2O e MeOH.[51] L'analisi 1H NMR effettuata sul
prodotto, isolato dalla purificazione cromatografica, ha mostrato però l'ottenimento del prodotto di apertura del ciclo ossazolonico (Schema 14).
2.3.4 Sintesi in condizioni termiche dei composti 18, 23, 24 e 25
In un secondo momento ci siamo concentrati sulla sintesi di composti ossazolonici partendo da aldeidi a struttura bifenilica. Questa decisione si è basata su evidenze sperimentali che avevano dimostrato come la presenza di un secondo ciclo benzenico portasse ad un aumento dell'attività di questi derivati nei confronti della MAGL. Come precedentemente descritto nel capitolo 2.1, il gruppo di ricerca presso cui ho svolto la parte di sintesi della mia tesi, era stato sintetizzato il seguente composto (Figura 21):
Schema 13. Tentativo di ciclizzazione su acetofenone tramite utilizzo di piombo acetato anidro in
THF anidro
Schema 14. Tentativo di metilazione della porzione vinilica con l'utilizzo di trimetilsilildiazometano
O O
NH O
OH
Pb(IV)acetato anidro THF anidro Reflux Nessuna reazione (SM) Ac2O 14 2 N O O CH3 TMS-CH2N2(1 eq.) Et2O MeOH OCH3 O HN O N O O CH3 (1 eq.) CH3 15 3
La progettazione di un inibitore benziliden-ossazolonico sostituito con un secondo anello benzenico si basava sulla descrizione topologica, riportata in letteratura, del sito catalitico della MAGL, in cui è stato osservato un lungo tunnel idrofobico. I risultati preliminari dei saggi enzimatici avevano dimostrato che effettivamente la presenza del secondo anello in posizione para determina un aumento dell'attività inibitoria rispetto a quella del composto 3 (IC50 = 1.1 μM per CG-231, IC50 = 24.1 μM per il composto 3). Risultava quindi interessante
introdurre altri anelli benzenici, variamente sostituiti, anche nelle posizioni orto e meta, allo scopo di valutare eventuali correlazioni fra l'aumento dell'attività e la posizione del secondo anello aromatico.
Per la sintesi dei composti che andrò ora a descrivere si è seguito lo stesso schema sintetico generale, che, riassumendo, è composto da due reazioni:
• Cross-coupling in condizioni di Suzuki utilizzando acidi boronici opportunamente sostituiti
• Ciclizzazione ad ossazolone utilizzando le classiche condizioni di reazione descritte nel capitolo 2.2
Inizialmente, il coupling nelle condizioni di Suzuki è stato effettuato per introdurre un sostituente fenilico sul prodotto commerciale 2-clorobenzaldeide.[52] L'analisi 1H NMR, sul
prodotto purificato mediante colonna cromatografica, ci ha confermato l'ottenimento del prodotto di coupling 17; in cui i due anelli benzenici sono in orto; tale composto è stato poi sottoposto a reazione di ciclizzazione a formare l'ossazolone 18. Lo spettro 1H NMR
eseguito sul prodotto purificato ci ha mostrato i segnali relativi al prodotto desiderato (Schema 15).
Figura 21. Struttura derivato
CG-231
N O
O
Successivamente, abbiamo ripetuto la stessa sequenza di reazioni (cross-coupling, ciclizzazione) sul prodotto commerciale 3-bromobenzaldeide, allo scopo di introdurre il sostituente fenilico in posizione meta, scegliendo acidi boronici diversi per ottenere i composti 23, 24 e 25 (Schema 16).
Prodotto Ar
23
24
25
Tabella 1. Natura del gruppo Ar
MeO
Schema 15. Coupling di Suzuki sulla 2-clorobenzaldeide e successiva ciclizzazione ad ossazolone
Schema 16. Sintesi generale dei composti
23-25 F CHO Cl CHO B(OH)2 Pd(OAc)2/PPh3 Na2CO32M Toluene dist. EtOh ass. AcONa 100 °C Reflux N O O CH3 16 17 18 N-acetilglicina Ac2O CHO Br
Acido Boronico opportuno Pd(OAc)2/PPh3 Na2CO32M Toluene dist. EtOH ass. 100 °C 24 ore 19 CHO Ar 20 Ar = Ph 21 Ar = p-OCH3-C6H4 22 Ar = p-F-C6H4 N O O CH3 Ar 23-25 N-acetilglicina Ac2O AcONa 100 °C Reflux (4-5 ore)
La reazione di coupling nelle condizioni di Suzuki rappresenta un'interessante procedura sintetica, che permette di ottenere, con rese elevate, la formazione selettiva di un nuovo legame Csp2-Csp2 fra anelli aromatici. La procedura della reazione di coupling prevede una
fase iniziale in cui PPh3, EtOH assoluto, toluene distillato e Pd(OAc)2 vengono fatti reagire
insieme in una fiala, sotto flusso di N2, per formare Pd(PPh3)4, ovvero un complesso del
Pd(0) che catalizza la reazione di formazione del composto bisarilico. Successivamente, alla miscela di reazione, si aggiungono la benzaldeide (opportunamente sostituita con un alogeno), la base Na2CO3 e l'acido boronico. Il ciclo catalitico della reazione è riportato nello
schema sottostante per la sintesi del composto modello 20 (Schema 17).
La prima reazione del ciclo corrisponde alla reazione di riduzione in situ del Pd(II) a Pd(0) catalitico; questa reazione viene preferita rispetto all’utilizzo dei complessi Pd(0) in commercio a causa della loro scarsa stabilità nelle condizioni ambientali. Il Pd(0) si
Schema 17. Ciclo catalitico del coupling di Suzuki.
Pd (0) CHO Br Addizione ossidativa Eliminazione riduttiva CHO Pd(II)-Br B(OH)2 Na2CO3 B(OH)3 CHO (II)Pd CHO Pd(OAc)2 Transmetallazione
comporta da nucleofilo e pertanto attacca mediante una reazione di addizione ossidativa la 3-bromobenzaldeide. A questo punto il complesso arile-Pd(II) agisce da elettrofilo sull’acido boronico per dare origine a quella che è la reazione chiave di tutto il ciclo catalitico, la reazione di transmetallazione. In questo step è richesta una base in ambiente acquoso perché l’acido boronico è molto stabile: la base rende il legame carbonio-boro dell’acido boronico più debole e labile, e l’atomo di boro si carica negativamente così da poter andare incontro alla reazione di transmetallazione. Il composto formatosi va quindi incontro ad una eliminazione riduttiva, a seguito della quale il Pd(0) viene rigenerato e si forma il composto bisarilico atteso.
Per quanto riguarda la reazione che ha condotto alla formazione del derivato ossazolonico 24, l'analisi dello spettro 1H NMR ha mostrato l'ottenimento della miscela tra
prodotto di reazione e starting material. Pertanto, per cercare di eliminare l'aldeide di partenza, abbiamo condotto una reazione utilizzando come scavenger la resina PS-TsNHNH2,riuscendo in questo modo ad ottenere il composto desiderato puro (Schema 18).
Schema 18. Trattamento della miscela con la resina per eliminare l'aldeide di partenza
S NHNH2 O O Dry THF MeO CHO OMe N O O CH3 OMe N O O CH3 21 24 24 S NHN O O CH OMe 26
2.3.5 Tentativo di deprotezione del prodotto 21 con BBr
3Per arricchire la libreria di composti sintetizzati, e, in particolare, per cercare di introdurre sui composti a struttura beniliden-ossazolonica nuovi possibili punti farmacoforici per l'interazione con l'enzima, il derivato 21 è stato sottoposto a reazione con tribromuro di boro in DCM anidro per ottenere il rispettivo prodotto O-demetilato.[53]
Il tribromuro di boro (BBr3) è un acido di Lewis molto forte; la demetilazione avviene
mediante la formazione di un complesso fra l’atomo di boro e l’ossigeno etereo. Questo passaggio è seguito dall’eliminazione di un alchil-bromuro per formare un dibromo(organo)borano che a sua volta può andare incontro a idrolisi per dare un alcol o un fenolo, acido borico (H3BO3) e Hbr (Schema 19).
La procedura sintetica prevedeva inizialmente di solubilizzare il composto 21 in CH2Cl2
anidro; dopodiché la reazione è stata raffreddata a -78 °C e trattata con BBr3 goccia a goccia.
L'analisi 1H NMR dopo la purificazione, mediante colonna cromatografica, ha mostrato però
l'ottenimento di una miscela complessa di difficile interpretazione.
Nonostante ciò, su una frazione di questa miscela è stata eseguita la reazione con le classiche condizioni di formazione degli ossazoloni.[45] I segnali ottenuti dallo spettro 1H
NMR hanno evidenziato l'ulteriore formazione di una miscela complessa che esclude la formazione del prodotto desiderato (Schema 20).
Schema 19. Meccanismo della reazione di demetilazione con tribromuro di boro
O CHO 21 B Br Br Br O CHO B Br Br Br CH3Br O CHO Br2B H2O B(OH)3 HO CHO 27
2.3.6 Riduzione palladio-catalizzata del prodotto 23
Ai fini della comprensione del meccanismo di interazione di questi derivati con l'enzima MAGL, era rilevante riuscire ad ottenere un composto privo della porzione α,β-insatura per mezzo di una reazione di idrogenazione catalitica del doppio legame. Il prodotto 23 è quindi stato sottoposto a reazione di riduzione con H2/Pd-C allo scopo di ottenere il derivato saturo
28 (Schema 21).[54]
Lo spettro 1H NMR del prodotto purificato per mezzo di una colonna cromatografica ha
evidenziato la presenza del segnale attribuibile all'ossidrile enolico. Tale ipotesi ha trovato conferma nell'analisi ripetuta utilizzando D2O. Infatti gli idrogeni dei gruppi ossidrilici, a
differenza della maggior parte dei protoni, hanno la capacità di andare incontro a rapido scambio con altri protoni “mobili”, ma tale scambio avviene facilmente con il deuterio dell'acqua pesante e questo permette la rapida identificazione dei segnali attribuibili ai protoni ossidrilici. L'aggiunta di D2O determina, infatti, lo scambio H-D a livello del protone
ossidrilico e la scomparsa del relativo segnale nello spettro 1H NMR.
ROH + D2O <-> ROD + HOD
Schema 20. Tentativo di ciclizzazione sul prodotto di demetilazione
Schema 21. Riduzione del doppio legame sul composto 12
HO CHO O NH O OH Ac2O AcONa 100 °C Reflux Nessuna reazione 27 2 N O O CH3 H2/Pd-C AcOEt N O O CH3 N O OH CH3 23 28a 28b
Dopo aver solubilizzato il composto 28 in D2O è stato effettuato l'esperimento 1H NMR
dopo 5' e dopo 1.30 h e si è osservata una netta attenuazione del segnale attribuibile all'OH. Pertanto, è stato così dimostrato che il prodotto di riduzione era presente unicamente in forma enolica.
2.3.7 Tentativo di sintesi del ciclo ossazol-5-onico
Come ulteriore obiettivo sintetico, risultava interessante la sintesi del solo ciclo ossazol-5-onico, per valutarne la reattività sottoponendolo a reazioni di attacco nucleofilo. In particolare, il nostro obiettivo era, una volta sintetizzato il solo ciclo ossazolonico, provare a legarvi differenti specie nucleofile allo scopo di valutare se fosse possibile percorrere questa via sintetica per ottenere altri derivati. Inoltre era importante ottenere informazioni relative al comportamento e alla stabilità del nucleo ossazolonico nelle reazioni con vari tipi di nucleofili.
La procedura riportata in letteratura per la sintesi di tale nucleo, prevede l'utilizzo della
N-acetilglicina, la quale, solubilizzata in toluene, è trattata in sequenza con trietilammina e
etilcloroformiato.[55][56] Tuttavia, l'analisi dello spettro 1H NMR ha escluso la presenza del
prodotto desiderato (Schema 22).
Con questo tentativo si è conclusa la parte relativa alla sintesi del mio progetto di tesi; nonostante alcune reazioni non abbiano fornito il prodotto che ci aspettavamo, grazie alla procedura sintetica utilizzata siamo comunque riusciti a costruire una piccola libreria di composti sufficientemente diversi l'uno con l'altro dal punto di vista strutturale. I risultati dei saggi di inibizione enzimatica, uniti agli studi computazionali sui derivati benziliden-ossazolonici, ci potranno poi suggerire quali siano i derivati maggiormente attivi e indirizzarci verso nuove possibili strutture da sintetizzare.
Schema 22. Tentativo di sintesi del ciclo ossazolonico
O NH O OH 2 Cl O O 29 Trietilammina Toluene Nessuna Reazione
