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Studi di Relazioni Struttura-Attività (SAR)

4. Studi Computazionali: Risultati e Discussione

4.3 Studi di Relazioni Struttura-Attività (SAR)

L'ultima parte del mio progetto di tesi si è svolta effettuando studi di SAR sui derivati benziliden-ossazolonici, per cercare di trovare dei nuovi punti di interazione con il sito di legame della MAGL. Questo passaggio rappresenta uno step interessante in quanto permette di andare a cercare nuovi potenziali inibitori di questo enzima che mantengano lo scaffold benziliden-ossazolonico, ma che presentino dei nuovi sostituenti allo scopo di individuare nuove interazioni che permettano un possibile aumento di attività di questi derivati. Questo passaggio rappresenta un primo passo per lo sviluppo di un primo modello farmacoforico di questo tipo di molecole nei confronti della monoacilglicerolo lipasi.

La strategia utilizzata per la ricerca di nuovi potenziali inibitori dell'enzima MAGL attraverso studi di relazioni struttura-attività si è così svolta:

benziliden-ossazolonico che presentassero dei sostituenti che potessero fungere da nuovi punti di interazione con la proteina;

2. Docking covalente attraverso l'utilizzo del programma GOLD delle strutture ipotizzate;

3. Valutazione dei risultati dei calcoli di docking attraverso il programma UCSF CHIMERA, andando a ricercare delle possibili nuove interazioni polari tra ligando e proteina;

4. Simulazione di dinamica molecolare sulle strutture che mostravano dopo il calcolo di docking nuove interazioni di tipo H-bond donor e/o H-bond acceptor;

5. Analisi dei risultati derivanti dalla dinamica mediante la visualizzazione su UCSF CHIMERA e valutazione della stabilità dei legami a idrogeno presenti durante il corso della simulazione attraverso la funzionalità Ptraj.

Docking covalente

Sono state sottoposte a calcolo di docking circa 50 nuove molecole che riportassero il motivo strutturale benziliden-ossazolonico variamente sostituito con gruppi funzionali che potessero andare ad interagire con i residui amminoacidici presenti nei pressi del sito di interazione di questi composti.

Prima di iniziare il docking non è stato necessario ripetere la fase di validazione, in quanto già effettuata durante la prima fase di studio.

Per effettuare l’analisi dei risultati, abbiamo sfruttato ancora una volta il software UCSF CHIMERA. Dopo aver convertito i risultati di Gold dal formato SDF al MOL2, abbiamo utilizzato lo strumento ViewDock, facente parte della suite UCSF CHIMERA. Esso ci permette di esaminare in modo rapido i risultati del docking considerando per ogni molecola la capacità di interagire con un determinato amminoacido. Per prima cosa abbiamo considerato la capacità dei singoli composti di interagire con il sito di legame, inoltre è stata presa in considerazione ogni interazione sia di tipo H-bond donor che H-bond acceptor che il ligando mostrava dal calcolo di docking.

Dinamica Molecolare

interazioni, visualizzate dopo il docking, rappresenta l’ultima fase di ricerca. Lo scopo è quello di verificare la validità delle pose di docking proposte e l’efficacia delle nuove interazioni nel complesso ligando-proteina.

Avendo già condotto lo studio di prova non è stato necessario ripetere l’indagine preliminare per la validazione dei parametri.

L’analisi della stabilità del complesso è stata valutata grazie all’uso della comando Ptraj (vedi capitolo 7.2.6), che si avvale del file di input hbonds, e che darà come file di output un testo che contiene la percentuale di permanenza dei legami a idrogeno che si presentano lungo il corso della dinamica.

Valutazione dei risultati

Tra le 50 molecole disegnate e sottoposte a questo tipo di analisi i risultati più promettenti si sono ottenute andando a modificare in modo opportuno la molecola denominata Lig-16 che presenta una porzione di tipo ftalimmidico legata al nucleo benziliden-ossazolonico.

Questa struttura sottoposta a docking e dinamica non ha mostrato la presenza di interazioni aggiuntive rispetto a quelle osservate per i composti sintetizzati. Tuttavia la porzione ftalimmidica rappresenta un interessante motivo strutturale in quanto oltre a fittare dentro una tasca lipofila, presenta dei potenziali punti farmacoforici costituiti dai due carbonili e dall'NH. Risulta quindi interessante cercare di modificare il Lig-16, introducendo dei sostituenti che permettano alla molecola di assumere una determinata conformazione all'interno del sito attivo in modo da formare nuove interazioni. Abbiamo cercato così di introdurre vari tipi di catene laterali sia sul nucleo ftalimmidico che sulla porzione benziliden-ossazolonica e il risultato più promettente si è ottenuto con la molecola Lig-31.

Figura 30. Struttura 2D Lig-16

N O O CH3 HN O O

Questa struttura dopo il calcolo di docking ha mostrato una interessante interazione tra un carbonile ftalimmidico e il gruppo NH della catena principale della Leu205. Dunque abbiamo così sottoposto la seguente molecola a dinamica molecolare per vedere se questa interazione era mantenuta durante la simulazione. La visualizzazione dei risultati con UCSF CHIMERA ci ha tuttavia mostrato che l'interazione con Leu205 non è stata mantenuta, mentre nelle condizioni in cui è stata eseguita la dinamica si è venuta a formare una diversa interazione fra l'NH ftalimmidico e il carbonile della catena principale della Pro178. A seguito dell'analisi della stabilità del complesso eseguita attraverso il comando Ptraj il file di output Results_hbonds, che contiene la percentuale di permanenza dei legami a idrogeno, si è verificato che questa interazione è stabile per il 50% del calcolo di dinamica molecolare.

Figura 31. Struttura 2D Lig-31

N O O CH3 HN O O CF3 O N

Dato che la struttura cristallografica della MAGL ha evidenziato una cavità di legame lipofila e allungata e che gli inibitori irreversibili più promettenti che abbiamo sintetizzato sono caratterizzati da una porzione bifenilica legata al ciclo ossazolonico, risultava importante valutare se la presenza di un ulteriore anello benzenico potesse determinare una maggiore affinità per il sito di legame. Per questo motivo sono stati sottoposti a docking e successiva simulazione di dinamica molecolare i seguenti composti (Tabella 3):

Figura 32. Sovrapposizione fra il risultato del calcolo di docking (verde) e calcolo di dinamica

# Composto Lig-32 Lig-33 Lig-34 Lig-35 Lig-36 Lig-37

Tabella 3. Strutture 2D ligandi trifenilici

N O O CH3 N O O CH3 N O O CH3 N O O CH3 N O O CH3 N O O CH3

Il risultato della simulazione di dinamica molecolare riguardante i composti riportati nella tabella soprastante ci hanno mostrato che le molecole con questa caratteristica strutturale possono presentare una potenziale maggiore affinità col sito d'interazione dell'enzima. Nelle immagini sotto riportate sono raffigurati i risultati della simulazione di dinamica molecolare:

Figura 33. Visualizzazione risultato dinamica

molecolare composto Lig-32

Figura 34. Visualizzazione risultato dinamica

Figura 36. Visualizzazione risultato dinamica

molecolare composto Lig-35

Figura 37. Visualizzazione risultato dinamica molecolare composto

Lig-36

Figura 35. Visualizzazione risultato dinamica molecolare composto

Da queste immagini possiamo notare che per ognuno di questi composti, la presenza di un terzo sostituente fenilico potrebbe avere ripercussioni in positivo sull'affinità e sull'attività di questi composti sull'enzima MAGL in quanto la struttura del sito catalitico presenta varie tasche lipofile all'interno delle quali i sostituenti fenilici possono “accomodarsi”. Da questi risultati sembra inoltre che non sia importante la posizione relativa dei due anelli benzenici sulla struttura benziliden-ossazolonica in quanto per ciascuno dei composti disegnati ed analizzati i due fenili si sistemano in tasche differenti interagendo con amminoacidi di tipo lipofilo, rappresentati principalmente da leucine e isoleucine.

Con questo interessante risultato si è quindi concluso il mio progetto di tesi; da questi ultimi dati è possibile ricavare una importante indicazione per potenziali sviluppi futuri di inibitori dell'enzima MAGL: la struttura benziliden-ossazolonica sostituita con due fenili potrebbe costituire uno scaffold che rappresenti la base per la costruzione di nuovi inibitori irreversibili, a seguito di modifiche opportune.

Figura 38. Visualizzazione risultato dinamica

5. Conclusioni e

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