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7. Studi Computazionali: Materiali e Metodi

7.1 Introduzione generale a GOLD

7.1.1 Preparazione dei file di input

Preparazione della proteina

La procedura è la stessa sia che si usi una proteina singola sia che si usi un complesso. Usare come file di input il complesso è preferibile, poiché è più facile rilevare il sito di legame. Una terza opzione è quella di introdurre solo la regione di interesse intorno al sito di legame, in tal caso è necessario assicurarsi che tutti i residui inclusi siano completi, inoltre si raccomanda di includere una regione di raggio superiore a 5 Å.

La proteina deve contenere tutti gli atomi di idrogeno, compresi quelli necessari per definire la corretta ionizzazione. Questa operazione può essere eseguita da Hermes se si è sicuri che tutti i legami sono definiti correttamente.

GOLD è capace di individuare eventuali ioni metallici e di eliminarli automaticamente, inoltre consente di trattenere molecole d'acqua specifiche necessarie per il legame con la proteina; per queste molecole il programma può determinare automaticamente se dovrebbero essere vincolate o lasciate libere durante il docking. L'orientamento degli atomi di idrogeno può essere ottimizzato dal programma durante il docking e la posizione può essere variata di un raggio di 2 Å. L'acqua deve essere specificata in un file separato in formato MOL2, questi file possono essere caricati separatamente o estratti dal complesso iniziale. Per ogni

molecola d'acqua possono essere specificati i seguenti parametri: • On, usare l'acqua per docking;

• Off, non utilizzare l'acqua per il docking; • Toggle, lascia la scelta a GOLD.

Per quanto riguarda l'orientamento degli atomi di idrogeno le opzioni sono:

• Spin, GOLD ottimizza automaticamente l'orientamento degli atomi di idrogeno; • Trans_spin, si immette un valore di distanza entro il quale far girare e traslare la

molecola d'acqua;

• Fix, utilizza l'orientamento specificato nel file di input.

Nei vari calcoli di docking che sono stati portati avanti durante il progetto, sono sempre state usate catene proteiche estratte da raggi x disponibili in letteratura caratterizzati dal formato PDB. Questi file sono stati ripuliti da tutte le piccole molecole presenti a parte il ligando, usando il programma multifunzionale UCSF CHIMERA; i complessi così ottenuti sono stati usati come file di input per GOLD.

Il complesso così preparato è stato rifinito grazie ad Hermes con la procedura che segue: ➢ Dal pannello GOLD Setup selezionare Proteins e quindi LoadProtein;

➢ Selezionato il file che si desidera aprire, comparirà nella barra in alto una scheda che porta il nome della proteina, selezionandola si accede alle diverse opzioni necessarie per la preparazione del recettore;

Dal quadro Protonation&Tautomers cliccare AddHydrogens nella parte alta, nella parte bassa selezionando His Tautomer è possibile scegliere lo stato di protonazione dei residui di istidina;

Dal pannello Extract/Delete Waters selezionare le molecole d'acqua necessarie per il docking, se presenti, e cliccare su Extract Water For Docking (nel lavoro oggetto di studio, sono sempre state lasciate le opzioni predefinite Toggle e Spin);

Dal pannello Delete Ligands selezionare il ligando presente nel complesso e cliccare su Extract.

Completate queste operazioni la proteina è pronta per la definizione del sito di legame.

Definizione del sito di legame

Defining a Binding Site from an Atom, l'atomo viene selezionato manualmente e

vengono presi in considerazione tutti i residui presenti entro un certo raggio che deve essere specificato. Per impostazione predefinita il raggio è impostato a 10.0 Å. Così facendo entrano a far parte del sito di legame tutti i residui che hanno almeno un atomo all'interno del raggio e il sito così creato sarà evidenziato nell'interfaccia di Hermes;

Defining a Binding Site from a Point, il punto deve essere indicato dalle coordinate

XYZ approssimativamente al centro della cavità. Per quanto riguarda il raggio vigono le regole indicate sopra;

Defining a Binding Site from a Reference Ligand, per poter utilizzare questa opzione

bisogna aver estratto un ligando o averne caricato uno. Un elenco dei ligandi disponibili è visualizzato nell'interfaccia di Hermes. Per default tutti gli atomi della proteina all'interno di un raggio di 5.0 Å da ogni atomo del ligando entrano a far parte del sito di legame;

Defining a Binding Site from a List of Atoms or Residues, per usare questa opzione

bisogna avere a disposizione un file contenete la lista dei residui che fanno parte del sito di legame, questo avviene, per esempio, quando si è già lavorato sul target e si dispone del file creato durante una sessione precedente.

Solo gli atomi specificamente inclusi nella definizione del sito di legame saranno presi in considerazione durante il docking. Il sito dovrebbe essere sufficientemente grande da contenere grandi ligandi e comprendere tutti gli atomi o residui che potrebbero essere coinvolti nel legame. Ogni atomo presente nel sito ora è virtualmente bagnabile dal solvente, questo processo è svolto in due tempi:

1. Viene calcolata la superficie accessibile al solvente. Vengono individuati i potenziali donatore e accettore di legame ad idrogeno e considerati come punti di ancoraggio; 2. I punti precedentemente individuati sono testati e vengono conservati solo quelli

accessibili al solvente.

La definizione del sito di legame potrebbe includere atomi che si trovano al di fuori della cavità (cioè sulla superficie della proteina),è possibile utilizzare un algoritmo di rilevamento della cavità (Generate a cavity atom file from the selection) per limitare la regione di interesse a parti concave del sito di legame. Nel caso in esame avendo sempre usato

complessi come file di input, per la definizione del sito, è stato usato come guida il ligando di riferimento. La procedura è la seguente:

Dal pannello GOLD Setup selezionare la cartella Global Options e quindi il quadro

Define Binding Site, da qui spuntare One or more ligand e selezionare il ligando

estratto durante la preparazione della proteina;

Spuntare l'opzione Generate a cavity atom file from the selection.

Flessibilità delle catene laterali

Per quanto riguarda la flessibilità delle catene laterali è possibile specificare se una o più di esse rimane libera o può ruotare attorno ad un asse e ciò può rendere il docking più difficile perché aumenta la quantità di spazio che deve essere esplorato. Questa opzione, inoltre, può anche aumentare la probabilità di falsi positivi pertanto come impostazione predefinita tutte le catene laterali sono trattate come rigide.

Per rendere flessibile una catena laterale bisogna specificare quali rotameri sono consentiti e per ognuno di essi specificare gli angoli di torsione, per ciò può essere impostato un massimo di dieci catene laterali flessibili. Il grado di libertà dei rotameri può essere definito nel seguente modo:

• Rigid: Viene considerata la conformazione input;

• Free: Per consentire ad una catena laterale di ruotare liberamente;

• Library: I rotameri vengono presi da una libreria interna al programma che contiene tutte le conformazioni più comuni;

• Crystal: Il valore attorno al quale varia la rotazione delle catene laterali viene preso dal file di input;

• From Dials: Questi rotameri possono essere specificati direttamente.

Analizzati i lati positivi e negativi legati all'utilizzo di questa procedura, nel lavoro, le catene laterali sono state lasciate quasi sempre rigide salvo che in alcuni casi specifici. La procedura usata per dare flessibilità alle catene è la seguente:

Dal pannello GOLD Setup selezionare la cartella Nome Prote quindi il quadro

FlexibleSidechains, da qui è possibile selezionare la catena che si vuole liberare e

premere Edit;

➢ Ripetere l'operazione per tutte le catene da liberare.

Preparazione dei ligandi

Per prima cosa bisogna aggiungere tutti gli atomi di idrogeno, compresi quelli necessari per definire la corretta ionizzazione ed il giusto stato tautomerico. Se tutti i legami sono definiti correttamente GOLD potrà aggiungere gli idrogeni automaticamente. La geometria iniziale del ligando dovrebbe essere ragionevolmente a bassa energia visto che GOLD non è in grado di modificare le lunghezze di legame, gli angoli o ruotare legami rigidi quali legami ammidici e doppi legami. Tuttavia, esiste la possibilità di ottimizzare i valori degli angoli di torsione attorno a legami rotabili.

La precisa posizione degli atomi di idrogeno di gruppi molto mobili, come ossidrili ed ammine, può non essere specificata in quanto sarà ottimizzata durante il processo di docking. Se non si conosce la stereochimica di legami rigidi come quelli ammidici bisogna far generare al programma tutte le combinazioni possibili.

I ligandi usati per il calcolo di docking sono costituiti dalle molecole precedentemente sintetizzate e illustrate nella Tabella 2. (capitolo 3, pag 40-42); queste molecole sono state preparate, minimizzate e sottoposte ad analisi conformazionale con MAESTRO. Per il caricamento dei ligandi è stata seguita la procedura che segue:

Dal pannello GOLD Setup selezionare la cartella Global Options e quindi il quadro

Select Ligands, da qui con il pulsante Add è possibile importare i ligandi;

➢ Una volta caricati cambiare l'opzione GA Runs e portare il valore da 10 a 30 per aumentare il numero di calcoli effettuati per ogni docking;

Selezionare il quadro LigandFlexibility e spuntare le opzioni FlipPyramidal N e Flip

ring corners.

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