Creazione del ceppo complementato per CpALS

Allo scopo di valutare se la significativa riduzione nella capacità adesiva alle cellule buccali osservata per il mutante nullo rispetto al wild type fosse effettivamente ascrivibile alla delezione del gene CpALS3, è stato creato un ceppo ricostituito

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introducendo una copia wild type del gene CpALS3 nel background mutante nullo (CpALS3KOb). La regione codificante il gene CpALS3 (4439 bp, compresi 26 bp a monte e 261 bp a valle) è stata amplificata tramite PCR utilizzando la coppia di primer 5COMF2 e 5COMR2 (Tabella 2.3). Il prodotto di amplificazione è stato in seguito digerito con gli enzimi di restrizione ApaI e XhoI. Parallelamente, il plasmide P3ALS3 è stato digerito con i tre enzimi ApaI, XhoI e SacI. I prodotti di entrambe le digestioni sono stati sottoposti a migrazione elettroforetica per valutare il corretto peso molecolare (Figura 3.6).

Figura 3.6: migrazione elettroforetica dei prodotti di digestione enzimatica in gel di agarosio 1% e

tampone TAE 1X. A) sequenza nucleotidica del gene CpALS3 amplificata (4.3 Kb) e digerita con gli enzimi ApaI e XhoI; B) plasmide P3ALS3 digerito con ApaI, XhoI e SacI con produzione di due frammenti: 4.7 Kb (cassetta SAT1-flipper+ 3’OM CpALS3) e 3 Kb (backbone del pBluescript); (M) marker di peso molecolare Gene ruler 1Kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

I prodotti della digestione enzimatica sono stati sottoposti a migrazione elettroforetica in un gel di low melting agar e frammenti di gel contenenti la banda di DNA di interesse sono stati asportati come descritto nel paragrafo 2.4.2 (Figura 3.7). Il gel è stato sottoposto a colorazione con bromuro di etidio solo dopo l’excisione della lane contenente il frammento di interesse. Questo accorgimento era messo in atto dal momento che il bromuro di etidio, in quanto agente intercalante degli acidi nucleici, avrebbe potuto mutare la sequenza codificante di CpALS3.

Cassetta SAT1-flipper + 3’OM ALS3 pBluescript backbone CpALS3 A) B) ! 5 Kb ! 4 Kb 3 Kb " 5 Kb " 4 Kb " 1 2 3 M M 1 2 3 4

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Figura 3.7: gel low melting in cui la porzione centrale della lane è stata asportata. Come è possibile

osservare, dopo colorazione con EtBr (0.5 µg/ml) sono visibili solo i margini laterali della banda di interesse. (M) marker di peso molecolare Gene ruler 1Kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

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La regione codificante per CpALS3, la cassetta SAT1-flipper con la regione 3’ di omologia di CpALS3 e il backbone del pBluescript, purificati come precedentemente descritto, sono stati sottoposti a ligazione per la costruzione della cassetta di complementazione. Il prodotto di ligazione, P3RALS3, è stato successivamente trasformato nel ceppo di E. coli DH10β reso competente come descritto nel paragrafo 2.3.4. Lo screening delle colonie trasformanti è stato eseguito tramite colony PCR amplificando due frammenti, rispettivamente di 2.1 Kb e 4.4 Kb, utilizzando i primer CPAG_05056F-But237 e 5COMF2-5COMR2 (Tabella 2.3). La prima coppia di primer amplifica una regione contenente una parte del gene CpALS3 e una parte della cassetta SAT1-flipper mentre la seconda coppia di primer amplifica l’intera sequenza codificante CpALS3. In entrambi i casi, i prodotti di amplificazione si ottenevano solo per quelle colonie che erano state trasformate con il plasmide di interesse. I prodotti di PCR sono stati quindi sottoposti quindi a migrazione elettroforetica per controllare l’avvenuta amplificazione (Figura 3.8).

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Figura 3.8: PCR di screening effettuata con i primer CPAG_05056F-But237 (Mix 1) e 5COMF2-

5COMR2 (Mix 2) allo scopo di identificare le colonie trasformanti positive per il plasmide P3RALS3; controllo positivo (CP) ottenuto aggiungendo DNA genomico (gDNA) del ceppo CpALS3WT; controllo negativo (CN) ottenuto non aggiungendo DNA alla miscela di reazione della PCR; marker di peso molecolare (M) Gene ruler 1Kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

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Tra le colonie risultate positive allo screening, ne è stata scelta una dalla quale il plasmide P3RALS3 è stato estratto e linearizzato mediante digestione. Il plasmide linearizzato è stato utilizzato come costrutto per la trasformazione tramite elettroporazione del ceppo CpALS3KOb privo di entrambi gli alleli del gene CpALS3, per creare il ceppo ricostituito.

Come descritto nel paragrafo 2.4.10, lo screening dei trasformanti è stato effettuato tramite colony PCR, utilizzando la coppia di primer UP4F1-A4REV1 (Tabella 2.3) per confermare la corretta integrazione della cassetta in uno dei due alleli deleti. Il prodotto di PCR è stato infine sottoposto a migrazione elettroforetica in gel di agarosio per confermare la presenza del frammento amplificato del peso molecolare atteso (1.5 Kb) (Figura 3.9).!!

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Figura 3.9: migrazione elettroforetica in gel di agarosio 1% e tampone TAE 1X della colony PCR

effettuata con i primer UP4F1 e A4REV1 per verificare la corretta integrazione della cassetta nel genoma. Lunghezza del frammento atteso: 1.5 Kb; Controllo positivo (CP) ottenuto utilizzando il gDNA estratto da CpALS3WT e controllo negativo (CN) ottenuto non aggiungendo DNA alla miscela di reazione della PCR; (M) marker di peso molecolare Gene ruler 1Kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

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Tra le colonie positive ottenute in screening, una stata scelta per l’excisione della cassetta SAT1-flipper. È stato effettuato un inoculo in terreno minimo YNB addizionato con maltosio 20 g/l allo scopo di attivare il promotore (CaMAL2) che regola l’espressione della ricombinasi flippasi all’interno della cassetta SAT1- flipper. A termine del periodo di incubazione, che variava tra le 24 ore e le 48 ore, venivano allestite delle diluizioni seriali e le diluizioni 10-5 e 10-6 della brodocoltura erano seminate su piastre YPD e YPD + Nou 100 µg/ml. Nelle piastre di terreno YPD agar crescevano sia le cellule che avevano exciso la cassetta che quelle che non avevano exciso. L’efficienza di excisione (rapporto tra il n° di CFU cresciute su YPD/ n° di CFU cresciute su YPD + Nou 100 µg/ml) è stata quindi calcolata. Qualora l’efficienza di excisione risultasse essere maggiore di 2 veniva effettuato un replica plating in terreno YPD agar in presenza dell’agente di selezione nurseotricina. Le cellule che crescevano in terreno YPD, ma non nel terreno addizionato con l’antibiotico, avevano exciso la cassetta, e avevano di conseguenza perso la resistenza alla nurseotricina. Per un’ulteriore conferma, a partire da queste colonie è stata effettuata una colony PCR allo scopo di valutare l’assenza della cassetta. I primer utilizzati erano CPAG_05056F e But237 (Tabella 2.3), i quali, in caso di presenza di cassetta, davano un prodotto di amplificazione di 2.1 Kb (Figura 3.10). M 1 2 3 4 5 6 7 8 CP CN gDNA CpALS3 UP4F1 A4REV1 P.M.= 1.5 Kb 1.5 Kb!

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! Figura 3.10:!migrazione elettroforetica in gel di agarosio 1% e TAE 1X della colony PCR effettuata con i primer CPAG_05056F e But237 allo scopo di verificare l’assenza della cassetta nel ceppo ricostituito nel gene CpALS3 exciso. Lunghezza del frammento atteso: 2.1 Kb. Le lane 1 e 3 hanno un amplificato del peso molecolare atteso attestando, per le due rispettive colonie, la presenza ancora della cassetta. Controllo positivo (CP) ottenuto utilizzando il plasmide P3RALS3 e controllo negativo (CN) ottenuto non aggiungendo gDNA alla miscela di reazione della PCR; (M) marker di peso molecolare Gene ruler 1Kb DNA Ladder (Thermo Scientific). Nella lane 1 e 3 è riportato il prodotto di PCR ottenuto su gDNA di ricostituiti con cassetta, mentre nella lane 5 è presente un esempio di ricostituito exciso. Nella lane 2, 4 e 6 è riportato il prodotto di PCR ottenuto amplificando un frammento di un gene

housekeeping utilizzato come controllo di accesso al genoma.

Una tra le colonie per cui lo screening in PCR aveva confermato l’excisione della cassetta è stata selezionata e denominata CpALS3Rb. Una procedura sperimentale analoga è stata utilizzata per l’integrazione del gene CpALS3 nel background del mutante nullo CpALS3KOa, al fine di ottenere il ceppo ricostituito anche nel lineage a (CpALS3Ra).

3.3 Spot assay

Dal momento che le Als sono glicoproteine localizzate a livello della parete cellulare, allo scopo di comprendere se la delezione del gene CpALS3 in C. parapsilosis avesse portato ad un disequilibrio a livello parietale è stato allestito un saggio, denominato

spot assay, per valutare la capacità dei ceppi in studio di crescere in YPD agar in

presenza e in assenza di agenti perturbanti la parete. I ceppi sottoposti a questo test sono stati il ceppo CpALS3WT, i mutanti eterozigoti (CpALS3Ha e CpALS3Hb) e nulli (CpALS3KOa e CpALS3KOb) e i ceppi ricostituiti (CpALS3Ra e CpALS3Rb). Gli agenti recanti stress parietale utilizzati nel saggio erano:

i. Congo red, un colorante azoico in grado di legarsi agli aggregati amiloidali e che interferisce con la corretta separazione dei lieviti in divisione provocando la formazione di lunghe catene di cellule con aberrazioni a livello di parete; ii. Fluconazolo, un antimicotico che interferisce con la sintesi dell’ergosterolo,

un componente essenziale per la membrana citoplasmatica dei funghi.

M 1 2 3 4 5 6 CP CN