Infezione intraemocelica di Galleria mellonella

Una prima valutazione della patogenicità dei ceppi WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb, CpALS3Rb è stata condotta utilizzando un modello di infezione sperimentale nel lepidottero Galleria mellonella. Un esperimento preliminare è stato effettuato per individuare la dose infettante appropriata da iniettare nelle larve di G. mellonella in modo da poter monitorare l’andamento dell’infezione nell’arco di 10 giorni. Una colonia del ceppo di riferimento di C. parapsilosis (ATCC 22019) veniva inoculata in 7 ml di terreno YPD e la brodocoltura era incubata O.N. a 37°C. Al termine dell’incubazione i lieviti venivano lavati con H2O e contati in camera di Bürker. Tre

differenti concentrazioni del ceppo WT in soluzione PBS (4x108 cellule/ml, 5x107 cellule/ml e 1x107 cellule/ml) sono state utilizzate per l’esperimento preliminare. Da ognuna di queste sospensioni erano prelevati 10 µl e, tramite l’utilizzo di una micro- siringa in vetro (Hamilton), era effettuata un’iniezione intraemocelica di 20 larve il cui addome era stato precedentemente lavato con un tampone imbevuto di etanolo. La dose infettante era rispettivamente di 4x106 cellule, 5x105 cellule e 1x105 cellule. Un controllo della vitalità delle larve, costituito da 20 larve non infettate, e un ulteriore

Materiali e metodi, 38

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controllo, costituito da 20 larve iniettate con 10 µl di PBS, erano aggiunti all’esperimento per verificare l’assenza di mortalità dovuta alla procedura sperimentale. Dopo ogni iniezione la siringa veniva lavata avvinandola prima con ipoclorito al 10%, poi con etanolo al 70% e, infine, con PBS. La percentuale di sopravvivenza era monitorata ogni 24 ore fino al decimo giorno dall’infezione. Per discriminare le larve vive da quelle morte veniva osservato il loro colore che in caso di morte da giallo diventava marrone scuro; inoltre le larve morte non rispondevano allo stimolo pressorio. Per ciascuna concentrazione allestita per l’esperimento venivano infine effettuate delle diluizioni in ragione 10 che venivano in seguito piastrate in piastre di YPD agar e incubate a 30°C.

Al termine dell’incubazione le piastre erano recuperate e le CFU venivano conteggiate per risalire alle concentrazioni delle soluzioni madri, per confermare la dose teorica di cellule iniettate nelle larve.

Sulla base dei risultati ottenuti, la dose infettante scelta per gli esperimenti successivi è stata di 8 x 105 lieviti/larva. Per ogni ceppo in studio (WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb) venivano iniettate 20 larve con la dose infettante prestabilita, in presenza dei gruppi di G. mellonella di controllo, come descritto precedentemente. Le larve erano incubate a temperatura ambiente e la mortalità veniva monitorata ogni 24 ore fino al decimo giorno post infezione. Come per l’esperimento preliminare, per ogni ceppo erano allestite delle diluizioni scalari e le diluizioni 10-5 e 10-6 piastrate in terreno YPD agar. Le piastre erano incubate a 30°C e le CFU conteggiate per risalire alla concentrazione della coltura utilizzata nel modello di infezione. I risultati ottenuti sono stati rappresentati mediante curve di Kaplan-Meier e l’analisi statistica dei dati è stata condotta mediante il Mantel-Cox test.

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Risultati, 39

3. Risultati

3.1 Caratterizzazione dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Ha, CpALS3Hb, CpALS3KOa, CpALS3KOb

3.1.1 Crescita in terreno liquido

Per ciascun ceppo in studio le curve di crescita sono state ripetute in tre esperimenti indipendenti, ognuno dei quali in duplicato. Nei grafici rappresentati in Figura 3.1 e 3.2 sono riportati i risultati ottenuti per le due linee di mutanti indipendenti, a e b, ottenute a partire dal ceppo di rifermento ATCC 22019. Le curve di crescita ottenute indicano che non ci sono differenze significative tra il ceppo wild-type e le due linee di ceppi eterozigoti e nulli per il gene CpALS3, dimostrando che la delezione di questo gene non compromette le capacità replicative di C. parapsilosis, almeno in terreno YPD.

Figura 3.1: Curva di crescita dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Ha,

!

! Figura 3.2: Curva di crescita dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb in YPD a 30°C. !

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Risultati, 40

Per ogni ceppo è stato calcolato inoltre il tempo di generazione in terreno YPD utilizzando la seguente formula:

! =log !!!− !"#!! log 2 = ! log !_!!!− !"#!_! 0.301 ! =!_! ! =1 !

(dove n= numero di generazioni, Nt= numero di cellule al tempo t, N0= numero di

cellule iniziale, R=velocità di crescita, t= tempo di incubazione, G= tempo di generazione)

Come si evince dalla Tabella 3.1, il tempo di generazione risulta essere simile per tutti i ceppi considerati.

Tabella 3.1: tempo di generazione, espresso in minuti, in YPD brodo a 30°C

Ceppo Tempo di generazione,

G (minuti) CpALS3WT 82.2 CpALS3Ha 67.2 CpALS3Hb 75 CpALS3KOa 78.6 CpALS3KOb 77.4

Infine, in Figura 3.3 (a, b, c) è riportato il numero di CFU (unità formanti colonia) in funzione della densità ottica misurata a 600 nm (OD600) in YPD. E’ possibile osservare una corrispondenza diretta tra OD600 e numero di CFU per ciascuno dei ceppi in esame, a conferma che la delezione di CpALS3 non si ripercuote sulla vitalità dei ceppi analizzati.

Figura 3.3: relazione tra OD600 e numero di CFU osservate per WT (a), CpALS3H (b), CpALS3KO

(c). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 1000000 2000000 O D 600nm CFU a) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 2000000 4000000 O D 600nm CFU b) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 1500000 3000000 4500000 O D 600nm CFU c)

Risultati, 41

3.1.2 Formazione pseudoife

La capacità di transire dalla forma di lievito ad una filamentosa, che è considerata un fattore di virulenza coinvolto nell’invasione dei tessuti dell’ospite, è stata valutata nei ceppi CpALS3WT, CpALS3Ha, CpALS3Hb, CpALS3KOa, CpALS3KOb. C.

parapsilosis non è in grado di produrre ife propriamente dette, ma in condizioni

inducenti, quali la presenza di siero bovino fetale (FBS 10%) e incubazione alla temperatura di 37°C, le cellule di lievito in divisione non si separano e tendono a formare delle strutture filamentose note come pseudoife. Come illustrato in Figura 3.4, sia il ceppo wild type che i ceppi mutanti sono risultati in grado di produrre pseudoife in condizioni inducenti. Pertanto, la delezione di una o entrambe le copie del gene

CpALS3 sembra non influire sulla capacità di C. parapsilosis di andare incontro a

morfogenesi.

Figura 3.4: osservazione microscopica dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Ha, CpALS3KOa dopo

incubazione per 24 ore a 37°C in terreno YPD + 10% FBS. Ingrandimento 400x. Le frecce indicano la presenza delle pseudoife.

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3.1.3 Valutazione delle proprietà adesive dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb a cellule epiteliali buccali umane (HBEC)

Allo scopo di meglio comprendere il contributo del gene CpALS3 nell’adesione di C.

parapsilosis alle superfici dell’ospite, è stato allestito per i ceppi CpALS3WT,

Risultati, 42

nei confronti di cellule buccali umane. Il saggio di adesione è stato ripetuto in tre esperimenti indipendenti e, per ogni esperimento, i ceppi sono stati analizzati in triplicato. Per ogni ceppo in studio, l’indice di adesività è stato definito calcolando il numero di lieviti adesi a 100 HBEC, rispetto al numero medio di lieviti adesi ottenuto con il ceppo CpALS3WT. Più precisamente, è stato effettuato il rapporto tra i singoli valori calcolati per il ceppo in esame e il valore medio calcolato per il ceppo CpALS3WT. Come si può osservare in Figura 3.5, per il ceppo CpALS3KOb si registra una sostanziale diminuzione nella capacità di aderire alle cellule HBEC. L’indice di adesività cala infatti più del 50% (valore medio 0.31 nei tre esperimenti) rispetto al ceppo wild type avente entrambe le copie funzionali di CpALS3 (p<0.01).

Figura 3.5: indice di adesività del ceppo wild type (CpALS3WT), eterozigote (CpALS3Hb) e mutante

(CpALS3KOb) a cellule buccali umane (HBEC). I valori ottenuti sono il risultato di tre esperimenti indipendenti in cui ogni ceppo è stato testato in triplicato. Le barre indicano il valore medio ottenuto + l’errore standard (SEM). Sottostante al grafico sono presenti quattro fotografie ottenute al microscopio ottico (ingrandimento 1000 x) e raffiguranti esempi di cellule buccali in presenza/assenza del ceppo

wild type e dei ceppi mutanti. Il controllo negativo, privo di cellule di lievito adese, attesta che il

donatore di cellule buccali non è portatore sano di Candida nella mucosa orale.