Una prima valutazione della patogenicità dei ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb è stata condotta utilizzando un modello di infezione in larve di G. mellonella.
Allo scopo di individuare la dose infettante che permettesse un adeguato monitoraggio della vitalità nel tempo , è stato condotto un esperimento preliminare nel quale il ceppo CpALS3WT è stato inoculato per via intraemocelica in un gruppo di 20 larve a differenti concentrazioni (4x106, 5x105, 1x105 cellule/larva). Delle tre dosi testate,
quella più elevata ha comportato la morte di tutte le larve nell’arco delle 24 ore, ed è stata quindi scartata. La dose infettante scelta è stata di 8x105 cellule/larva, intermedia tra le prime due saggiate. Ogni ceppo in studio è stato quindi inoculato per via intraemocelica alla concentrazione prestabilita in gruppi di 20 larve e la mortalità è stata monitorata per 10 giorni. La morte dell’insetto era facilmente individuabile in quanto la larva acquisiva una caratteristica colorazione bruna e non rispondeva alle sollecitazioni pressorie (Figura 3.13).
Risultati, 51
! Figura 3.13: differenze nella pigmentazione tra larve di G. mellonella non infettate e morte in seguito
all’infezione.
Sono stati effettuati tre esperimenti indipendenti, e i dati relativi ad un esperimento rappresentativo sono illustrati nella curva di Kaplan-Meier (Figura 3.14). In tutti gli esperimenti non è stata osservata una differenza statisticamente significativa nella patogenicità dei ceppi in studio. Le curve di sopravvivenza sono state confrontate tramite il Mentel-Cox log-rank test, il quale ha confermato l’assenza di differenze significative tra i ceppi in studio (P value=0.44). Al quinto giorno successivo all’infezione la sopravvivenza era del:
• 35% per le larve infettate con il ceppo CpALS3WT e CpALS3Hb; • 45% per le larve infettate con il ceppo CpALS3KOb;
• 30% per le larve infettate con il ceppo CpALS3Rb.
È tuttavia interessante notare che, al termine del periodo di incubazione (giorno 10), il ceppo CpALS3WT aveva causato l’85% di mortalità nelle larve ed i ceppi CpALS3Hb e CpALS3Rb l’80%, mentre un tasso di mortalità più ridotto (60%) è stato registratio per il mutante nullo CpALS3KOb.
!
Figura 3.14: Curva di Kaplan-Meier rappresentante la sopravvivenza di larve di G. mellonella
infettate con il ceppo wild type, mutante eterozigote (CpALS3Hb), mutante nullo (CpALS3KOb) e ricostituito (CpALS3Rb) (8x105 cellule/larva, n= 20 larve per gruppo). I controlli negativi sono
rappresentati da larve (n=20) non infettate e larve (n=20) iniettate con un uguale volume di PBS.
Discussione, 52
4. Discussione
L’adesione è considerata un evento cruciale nella colonizzazione fungina e nelle prime fasi del processo infettivo. L’adesività di un microrganismo alle superfici dell’ospite è mediata da una classe di proteine, note con il nome di adesine e localizzate sulla parete cellulare, in grado di interagire con specifici ligandi esposti sulla superficie delle cellule dell’ospite. La nostra attenzione si è concentrata su una classe di proteine, codificate da una famiglia genica, nota con il nome di ALS (Agglutinin-like sequence), identificata in un primo momento in C. albicans e successivamente anche in C. parapsilosis. Dei 5 geni codificanti per le proteine Als,
CPAG_05056, successivamente indicato come CpALS3, è stato scelto come primo
bersaglio per la delezione sito specifica, in quanto risulta il gene che presenta una più elevata omologia di sequenza con ALS3 di C. albicans. La proteina Als3 di C.
albicans è infatti implicata, nell’adesione a una vasta gamma di substrati differenti
e il suo ruolo di adesina è stato abbondantemente documentato in letteratura [35], [36], [37].
La collezione di ceppi di C. parapsilosis privi di uno o di entrambi gli alleli di
CpALS3 (CpALS3WT, CpALS3Ha, CpALS3Hb, CpALS3KOa e CpALS3KOb),
creata nel laboratorio dove è stato svolto il presente lavoro di tesi, è stata sottoposta ad analisi fenotipiche allo scopo di indagare l’effetto della delezione del gene sulla capacità di replicazione, di formare pseudoife, di aderire a cellule buccali umane (HBEC) e di indurre danno citotossico su linea cellulare. Infine, una prima analisi della patogenicità è stata condotta utilizzando come modello sperimentale di infezione il lepidottero Galleria mellonella.
La collezione di ceppi mutanti nel gene CpALS3, è stata sottoposta per prima cosa a valutazione delle capacità replicative in terreno liquido YPD. Le curve di crescita, ottenute del ceppo di riferimento e dei mutanti di entrambe le linee indipendenti mostrano un andamento sovrapponibile, con un tasso di crescita simile per i diversi ceppi. Quindi, la delezione del gene codificante per la proteina Als3 non compromette le capacità replicative di C. parapsilosis, almeno nel terreno comunemente utilizzato per la coltivazione di questo microrganismo.
La capacità da parte di un microrganismo di produrre ife rappresenta un fattore di virulenza coinvolto nell’invasione dei tessuti dell’ospite. All’interno del genere
Discussione, 53 Candida, solo C. albicans e C. dubliniensis sono in grado di produrre delle vere e
proprie ife. C. parapsilosis è incapace di produrre ife ma è in grado di formare, in determinate condizioni inducenti tra cui la presenza di siero e la temperatura di 37°C, delle strutture denominate pseudoife che si differenziano dalle ife propriamente dette per la presenza di restringimenti a livello del setto di giunzione. Nonostante in C. albicans la proteina Als3 sia direttamente correlata con la formazione delle ife, dal momento che la sua espressione risulta essere up-regolata durante questo processo [76], in C. parapsilosis la delezione di una o di entrambe le copie del gene CpALS3 non ha influito nella capacità di andare incontro a morfogenesi.
L’effetto della delezione del gene CpALS3 sull’integrità strutturale della parete cellulare di C. parapsilosis è stata indagata tramite un saggio denominato spot
assay. Due agenti perturbanti la parete, quali il Congo red e il fluconazolo, sono
stati utilizzati per confrontare la suscettibilità del ceppo wild-type con quella dei ceppi mutanti durante la crescita in presenza di concentrazioni sub-fungicide di tali composti. Il Congo red è un colorante azoico che, se aggiunto al mezzo di coltura, porta alla formazione di lunghe catene di cellule caratterizzate da aberrazioni a livello della struttura della parete. Più precisamente il Congo red è in grado di interagire con i β-1,3-glucani, i quali rappresentano i principali componenti della parete cellulare dei lieviti determinandone la rigidità. Il colorante, legandosi a questi polimeri polisaccaridici, impedisce la loro aggregazione a formare delle spesse fibrille [77].
Il fluconazolo è un antimicotico in grado di inibire l’enzima 14α-demetilasi richiesto per la conversione del lanosterolo in ergosterolo. L’ergosterolo è uno dei principali costituenti della membrana cellulare dei miceti, dove svolge le stesse funzioni svolte dal colesterolo nelle cellule animali. La sua conseguente mancanza, in seguito a trattamento con fluconazolo, si ripercuote a livello della membrana cellulare aumentandone sia la fluidità che la permeabilità ai farmaci. Indirettamente, gli effetti del trattamento con il fluconazolo si riflettono anche a livello dell’integrità della parete con una conseguente minore produzione di glucani [78]. Per sopperire allo stress indotto dal trattamento, in C. albicans l’esposizione a fluconazolo induce difatti la sovra-espressione di geni implicati nell’integrità e nella formazione di cross-link a livello della parete [78].
Discussione, 54
I risultati ottenuti nello spot assay attestano che non ci sono differenze rilevanti nella crescita tra il ceppo wild type e i ceppi mutanti di C. parapsilosis in seguito ad incubazione a 30°C e a 37°C sia in presenza di Congo red sia in presenza di fluconazolo. Questi dati dimostrano che l’assenza della proteina Als3 a livello della parete non ne destabilizza la struttura e non rende di conseguenza i ceppi, mancanti di una o di entrambe le copie dell’allele CpALS3, più suscettibili all’azione di questi agenti perturbanti. Una spiegazione a questi risultati può essere ricercata in un possibile riarrangiamento della struttura della parete che diviene probabilmente capace di sopperire alla mancanza della proteina Als3. Ulteriori studi di caratterizzazione della composizione ed organizzazione parietale dei ceppi in studio saranno necessari per verificare questa ipotesi.
Il ruolo della proteina Als3 di C. albicans nell’adesione all’epitelio orale è già stata documentata in letteratura tramite un saggio di adesione in vitro su ceppi mutanti in entrambi gli alleli di CaALS3. Più precisamente le capacità adesive di questi ceppi sono state valutate su epitelio umano ricostituito (RHE) [79] e sulla linea epiteliale tumorale TR146 [80]. In entrambi i casi si osserva una drastica riduzione nell’adesione dei ceppi mutanti di C. albicans rispetto al controllo costituito dal ceppo wild-type. Allo stesso modo, allo scopo di meglio comprendere il contributo di Als3 all’adesività di C. parapsilosis alle superfici dell’ospite, è stato allestito per i ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb e CpALS3KOb un saggio di adesione in vitro a cellule buccali umane esfoliate. Le cellule sono state prelevate da un singolo donatore sano dal momento che in uno studio precedente era stato osservato che la capacità di C. parapsilosis di aderire a cellule buccali prelevate da 4 differenti donatori non differiva significativamente [81]. I ceppi mancanti di entrambi gli alleli funzionali di CpALS3 (CpALS3KOa e CpALS3KOb) mostrano una forte riduzione nella capacità adesiva alle cellule buccali umane se paragonato al ceppo di riferimento wild-type, con una riduzione maggiore del 50% dell’indice di adesività (Figura 3.6). Questo dato attesta l’importante coinvolgimento di Als3 nell’adesione agli epiteli anche in C. parapsilosis. Il ceppo mutante eterozigote, mancante di una copia di CpALS3, non ha mostrato invece differenze nell’adesività rispetto al controllo positivo, a dimostrazione che la presenza di una singola copia funzionale del gene è sufficiente a ristabilire un fenotipo simile al wild-type. Alla luce dei dati ottenuti con la collezione di mutanti, il saggio di adesione alle cellule buccali esfoliate è stato ripetuto includendo il ceppo ricostituito, CpALS3Rb. I
Discussione, 55
risultati ottenuti dimostrano che la re-integrazione nel background del ceppo mutante nullo (CpALS3KOb) di una copia funzionale del gene CpALS3 ristabilisce il fenotipo wild-type, confermando quindi il ruolo della proteina Als3 nell’adesione. Successivamente al saggio di adesione, è stata valutata la citotossicità indotta dalla collezione di ceppi di C. parapsilosis nei confronti della linea cellulare A549, derivante da carcinoma polmonare umano con proprietà dicellule epiteliali. Nessun danno cellulare è stato riscontrato tramite la co-incubazione con i ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb anche se un danno quantificabile (44%) è stato riscontrato con il ceppo SC5314 di C. albicans, utilizzato in questo saggio come controllo positivo. Questi dati sono in accordo con uno studio precedente volto a comprendere la capacità di indurre danno cellulare a livello dell’epitelio intestinale prematuro da parte di un gruppo di specie appartenenti al genere Candida, tra cui C. parapsilosis, [82]. Anche in questo studio, il saggio adottato per la valutazione della citotossicità prevedeva la quantificazione del rilascio di LDH. Il saggio, eseguito utilizzando la linea cellulare, non tumorale, H4 come modello di epitelio intestinale immaturo, ha rivelato l’assenza di danno cellulare indotto dal ceppo di C. parapsilosis, a differenza del ceppo SC5314 di C. albicans, unica specie capace di indurre citotossicità nello studio. Per quanto riguarda le specie appartenenti al genere
Candida, la percentuale di danno indotto è fortemente influenzata dalla linea
cellulare impiegata nel saggio di citotossicità. Ad esempio, la citotossicità causata da un ceppo di C. tropicalis proveniente da un isolato clinico è stata valutata nei confronti di tre linee cellulari differenti: la linea cellulare TCC-SUP, proveniente da carcinoma alla vescica, la linea cellulare HeLa, originata da cancro alla cervice uterina e la linea cellulare Caco-2, ottenuta da adenocarcinoma del colon-retto [83]. Il danno cellulare registrato è molto variabile, con percentuali di citotossicità oscillanti tra il 14%, nel caso della linea TCC-SUP e l’1.5%, nei confronti delle cellule HeLa. La linea cellulare Caco-2 provocava invece un danno quantificato in un 6% di citotossicità. Nonostante C. albicans sia caratterizzata da una maggiore patogenicità rispetto alle altre specie di Candida, anche per questo microrganismo la percentuale di citotossicità risulta essere influenzata dal tipo di cellule impiegate nel saggio. Infatti, allo scadere di 12 ore di incubazione la percentuale di citotossicità indotta ammontava al 90% nel caso dell’utilizzo della linea cellulare tumorale TR-146, utilizzata come modello di epitelio buccale, e al 20% nel caso
Discussione, 56
dell’utilizzo della linea Caco-2 [84]. In accordo con la letteratura, C. parapsilosis non induce danno nelle cellule epiteliali, e questo non consente di verificare il contributo del gene CpALS3; anche se l’impiego di linee cellulari differenti potrebbe consentire una più fine valutazione.
Infine, il potenziale patogenetico della collezione di ceppi mutanti è stato verificato utilizzando un modello di infezione sperimentale non convenzionale nelle larve del lepidottero G. mellonella. I principali vantaggi dovuti all’utilizzo di questo invertebrato, rispetto al modello murino, risiedono nei costi ridotti, nella possibilità di lavorare in laboratori non specializzati, nell’assenza di problemi etici legati al suo utilizzo e nella possibilità di poter utilizzare un elevato numero di larve per esperimento. Inoltre, il range di temperatura entro il quale le larve possono essere mantenute, 25°C-37°C, permette di effettuare studi con la maggior parte dei funghi nelle condizioni di temperatura presenti nell’ospite umano, cosa non possibile, ad esempio, con altri invertebrati come Caenorhabditis elegans o Drosophila
melanogaster. Rispetto ad altri invertebrati che necessitano di ingerire il fungo (C. elegans ad esempio), non rendendo possibile una standardizzazione della dose
infettante, G. mellonella può essere inoculata con la sospensione del ceppo da saggiare tramite iniezione intraemocelica. D. melanogaster è inoltre nota per essere particolarmente resistente all’infezione fungina e un suo impiego in questo campo comporta la necessità di utilizzare linee di mutanti. Inoltre, studi di comparazione tra G. mellonella e il modello murino hanno confermato la conservazione del ruolo dei geni implicati nella virulenza dei funghi [85]. Seppur organizzato in modo più semplice rispetto ai mammiferi, il sistema immunitario di G. mellonella è costituito da 6 tipi di cellule ad attività fagocitaria: coagulociti, proemociti, sferulociti, plasmociti, granulociti e enocitoidi. Solitamente, la densità di emociti riscontrati nella larva è direttamente proporzionale alla patogenicità del ceppo saggiato. Similmente a quanto accade nei mammiferi, la presenza di patogeni induce nel lepidottero un aumento del numero di cellule implicate nella risposta immunitaria [86]. Pertanto, il modello sperimentale adottato in questo lavoro di tesi non si propone come modello sostitutivo a quello murino, ma offre la possibilità di effettuare dei primi screening sulla patogenicità dei ceppi in studio in previsione di studi più approfonditi sul topo. In questo studio, quindi i ceppi di C. parapsilosis utilizzati, CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb, sono stati inoculati tramite iniezione all’interno della cavità emocelica in gruppi di 20 larve
Discussione, 57
ciascuno. Un esperimento preliminare, impiegando il ceppo wild type, è stato eseguito per individuare la dose infettante appropriata in modo da poter monitorare l’andamento dell’infezione nell’arco di 10 giorni. Delle tre concentrazioni saggiate (4x108 cellule/ml, 5x107 cellule/ml, 1x107 cellule/ml), la prima è stata scartata in quanto provocava la morte delle larve nell’arco delle 24 ore, mentre le restanti due non provocavano morte nei giorni successivi di monitoraggio. La dose infettante scelta era di 8x105 cellule/larva. Allo scopo di rendere il più possibile riproducibile l’esperimento, oltre all’utilizzo di un inoculo standardizzato venivano scelte larve delle stesse dimensioni e dal colorito chiaro uniforme, scartando quelle aventi delle macchie grigie a livello addominale, in quanto potenziale indice di infezione. Giornalmente, la morte delle larve veniva annotata tramite osservazione della pigmentazione delle larve (che da giallo virava al marrone) e dell’assenza di reazione a stimoli pressori. In tutti e tre gli esperimenti effettuati non è stata osservata una differenza statisticamente significativa nella mortalità delle larve, attestando che, nel modello sperimentale adottato, i ceppi non differiscono nel potenziale patogenetico. Tuttavia, questo risultato non sorprende del tutto, dal momento che CpAls3 è un’adesina probabilmente implicata nelle prime fasi dell’infezione, e che evidentemente svolge un ruolo secondario nell’invasività dei tessuti dell’ospite. Tuttavia, in uno dei tre esperimenti è stato possibile osservare un ridotto tasso di mortalità nelle larve infettate con il ceppo CpALS3KO (60%) rispetto alle larve infettate con i ceppi wild type, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb (rispettivamente 85%, 80%, 60% e 80%), suggerendo una minore potenzialità patogenetica del ceppo difettico per Als3p. I dati ottenuti da questo primo approccio suggeriscono che, per poter osservare differenze nel potenziale patogenetico tra il ceppo wild type e i ceppi mutanti, sia probabilmente necessario utilizzare modelli di infezione mucosale della larve, nei quali Als3p potrebbe svolgere un ruolo di maggiore rilievo.
Conclusioni, 58
5. Conclusioni
Candida parapsilosis è un lievito patogeno opportunista considerato ad oggi la
seconda causa più comune di candidemia dopo Candida albicans. Nonostante la sua rilevanza clinica, poco è noto riguardo ai meccanismi di virulenza espressi da C.
parapsilosis durante l’instaurarsi del processo infettivo. Uno dei principali fattori
coinvolti nella patogenicità è l’adesione del microrganismo alle superfici dell’ospite, tratto indispensabile per la colonizzazione e l’invasione dell’ospite. A livello della parete cellulare dei funghi sono localizzate delle proteine, chiamate adesine, direttamente implicate nell’adesione alle superfici mucosali. Le adesine più studiate in
C. albicans appartengono alla famiglia genica ALS, composta da otto membri
(CaALS1-7 e CaALS9). Saggi di adesione, esperimenti di delezione genica e modelli di infezione in vivo e in vitro, hanno evidenziato l’importanza della proteina CaAls3 nel processo di adesione a superfici biotiche e abiotiche. La proteina Als3 è anche implicata nella formazione del biofilm, nell’invasione dei tessuti dell’ospite ed è stato infine osservato che la sua presenza induce la produzione di citochine. Studi di omologia sull’intera sequenza genomica di C. parapsilosis hanno permesso di identificare 5 geni omologhi ai geni ALS di C. albicans (CPAG_05314, CPAG_00368,
CPAG_05056, CPAG_05054, CPAG_00369). Il presente lavoro di tesi si è inserito
all’interno di un progetto più ampio volto alla comprensione del contributo di ciascuno dei geni ALS nell’adesione di C. parapsilosis a superfici biotiche e abiotiche, mediante l’allestimento di ceppi mutanti privi dei geni CpALS1-5. In particolare, il gene
CPAG_05056 (successivamente indicato come CpALS3), il cui omologo in C. albicans
svolge un ruolo di primaria importanza nella virulenza di questo lievito, era stato scelto come primo target per la delezione mediante ricombinazione omologa.
In questo studio, ceppi mutanti privi di una copia (eterozigote) o di entrambe le copie del gene CpALS3 (nullo), sono stati caratterizzati fenotipicamente.
Nel complesso i dati ottenuti hanno indicato che:
• La delezione di CpALS3 non compromette la vitalità dei ceppi in studio e la loro capacità replicativa almeno per quanto concerne le condizioni di crescita convenzionalmente utilizzate per la coltivazione di questo lievito;
• Sia il ceppo wild type che i ceppi mutanti, se sottoposti a crescita in condizioni inducenti, sono in grado di produrre pseudoife, a dimostrazione che la
Conclusioni, 59
delezione di CpALS3 non altera la capacità di C. parapsilosis di andare incontro a morfogenesi;
• I mutanti privi di entrambe le copie del gene CpALS3 mostrano una drastica diminuzione dell’adesività a cellule HBEC rispetto al ceppo wild type. La reintroduzione di una copia funzionale del gene CpALS3 ripristina il fenotipo
wild type, confermando il ruolo di CpALS3 nell’adesione a cellule buccali;
• Nessuna differenza è apprezzabile tra la crescita del ceppo wild type e i ceppi mutanti in presenza di agenti perturbanti la parete quali Congo red e fluconazolo;
• Nessun effetto citotossico è stato riscontrato co-incubando i ceppi CpALS3WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb, CpALS3Rb con la linea tumorale epiteliale A549;
• Nessuna differenza statisticamente significativa nel potenziale patogenico è stata individuata nella collezione di mutanti analizzati nel modello di infezione sperimentale di G. mellonella.
In conclusione quindi, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi dimostrano un diretto coinvolgimento del gene CPAG_05056 (CpALS3) nell’adesione di C.
parapsilosis alle superfici dell’ospite, in particolare a cellule buccali umane.
! ! ! ! ! ! ! ! !
Bibliografia, 60!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Bibliografia
1. Langeron M. and Talice R. 1932. Nouvelle méthodes d’étude et essai de