Saggio di citotossicità

La citotossicità indotta dai ceppi WT, CpALS3Hb, CpALS3KOb e CpALS3Rb sulla linea tumorale epiteliale umana A549, è stata valutata mediante il CytoTox96® Non-

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Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). Il saggio permetteva di quantificare l’enzima lattato deidrogenasi (LDH) rilasciato dalle A549 in seguito alla co- incubazione con i ceppi in studio. La reazione catalizzata dall’enzima LDH, che porta alla conversione del lattato in piruvato, viene accoppiata a un’altra reazione, catalizzata dall’enzima diaforasi, e che converte il sale di tetraziolio (INT) incolore in formazano, un prodotto di colore rosso. Era possibile risalire indirettamente alla concentrazione di LDH rilasciata, dal momento che la quantità di formazano presente, misurato tramite l’osservazione spettrofotometrica dell’assorbanza alla lunghezza d’onda di 490 nm (picco di assorbimento del formazano), era proporzionale alla quantità di LDH rilasciato.

2.5.1 Mantenimento in coltura della linea cellulare A549

La coltura della linea tumorale A549 era mantenuta all’interno di fiasche per colture cellulari di 75 cm2 (BD Falcon) in presenza di 22 ml di terreno costituito da:

• DMEM (Gibco); • FBS 10% (Aurogene);

• L- Glutammina 2mM (L-Gln, Lonza);

• Pen-Strep (100 U/ml penicillina e 100 U/ml streptomicina, Lonza).

Le cellule erano incubate a 37°C in presenza di 5% CO2 (Hera Cell 150), con il tappo

leggermente svitato per permettere gli scambi gassosi. Quando le cellule occupavano l’intera superficie a disposizione, e quindi erano a confluenza, era necessario trasferirle in una nuova fiasca. Il terreno veniva eliminato e la coltura lavata con 10 ml di DMEM allo scopo di allontanare cataboliti, cellule morte e il siero bovino fetale, in quanto inibitore della tripsina. Alla fiasca erano aggiunti 6 ml di una soluzione 170.000 U/l tripsina – 200 mg/l EDTA (Lonza). La tripsina degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule adese al fondo della fiasca mentre l’EDTA chela gli ioni Ca2+ _{e Mg}2+ _{indispensabili per l’adesione. La reazione veniva incubata per 5-6}

minuti a 37°C e 5% CO2. Le cellule tripsinizzate, e quindi non più adese al fondo della

piastra, apparivano rotondeggianti e libere di muoversi all’interno del terreno se osservate al microscopio ottico. La reazione enzimatica era inibita tramite l’aggiunta di un eguale volume di FBS 10% al quale venivano in seguito aggiunti 18 ml di terreno DMEM. La coltura veniva centrifugata e poi risospesa delicatamente in 3 ml di terreno completo, la cui composizione è riportata all’inizio del paragrafo. Una piccola aliquota della sospensione era diluita 1:10 in Trypan Blue per effettuare un conteggio

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delle cellule vitali in camera di Bürker. Una volta ottenuto il valore della concentrazione cellulare, la coltura veniva diluita per essere seminata in una nuova fiasca alla densità di 6500 cellule/cm2 in 22 ml di terreno completo. Seminate a questa densità, le A549 impiegavano circa 3-4 giorni per arrivare nuovamente a confluenza.

2.5.2 LDH assay

Il saggio di citotossicità era effettuato all’interno di piastre da 96 pozzetti dotati di fondo a “U” (Corning Incorporated) e si articolava in due giorni.

Durante il primo giorno la coltura di A549 veniva tripsinizzata come descritto nel paragrafo 2.5.1. Le cellule venivano successivamente contate in camera di Bürker e diluite alla concentrazione di 50000 cellule/ml. Venivano seminati, secondo un preciso schema illustrato nella Figura 2.5, 200 µl della sospensione di A549 in terreno DMEM addizionato con FBS 10% e L-Gln 2mM (concentrazione finale di 10.000 cellule/pozzetto). La micropiastra veniva incubata per 24 ore in un incubatore per linee cellulari a 37°C e 5% CO2. I ceppi di Candida in studio erano invece inoculati in 10

ml di terreno YNB addizionato con 2% di glucosio e incubati per 24 ore a 30°C in agitazione.

Il giorno seguente la coltura di lieviti veniva centrifugata e lavata con 10 ml di D-PBS. Le cellule erano contate in camera di Bürker e la concentrazione cellulare veniva calcolata come descritto nel paragrafo 2.2.2. La brodocoltura era infine diluita alla concentrazione di 1x106 cellule/ml e risospesa in terreno DMEM, FBS 0.5% e L-Gln 2mM. Da questa sospensione, per ogni ceppo venivano prelevati 150 µl e aliquotati all’interno di ogni pozzetto secondo lo schema illustrato in Figura 2.5 (concentrazione finale dei lieviti: 1,6 x 105 cellule/pozzetto). Nei pozzetti contenenti le A549 veniva precedentemente aspirato il terreno e le cellule erano lavate con D-PBS. La piastra era infine centrifugata a 250 x g per 4 minuti allo scopo di assicurare il contatto fra le cellule target (linea cellulare A549) e le cellule effettrici (ceppi di lieviti in studio) e incubata a 37°C in presenza di 5% CO2 per 4, 6, 8, e 16 ore.

Per ogni esperimento erano inoltre allestiti i seguenti controlli:

a) Rilascio spontaneo di LDH da parte delle cellule effettrici: a tale scopo ogni ceppo

in studio era incubato alla concentrazione utilizzata nel saggio e in assenza di cellule A549 in terreno DMEM, FBS 0.5% e L-Gln 2 mM (volume totale di 150 µl). Questo controllo permetteva di calcolare per ogni ceppo il background di lattato deidrogenasi

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rilasciato spontaneamente dai lieviti e veniva successivamente sottratto al risultato sperimentale;

b) Rilascio spontaneo di LDH da parte delle cellule target: i pozzetti contenevano le

cellule A549 seminate in terreno DMEM, FBS 0.5% e L-Gln 2 mM (volume totale di 150 µl). Questo controllo permetteva di calcolare per ogni ceppo il background di lattato deidrogenasi rilasciato spontaneamente dalle A549 e veniva successivamente sottratto al risultato sperimentale;

c) Rilascio massimo di LDH da parte delle cellule target: le cellule A549 venivano

seminate in terreno DMEM, FBS 0.5% e L-Gln 2 mM (volume totale di 150 µl). A questi pozzetti veniva in seguito aggiunto, 45 minuti prima del termine dell’incubazione, 15 µl di soluzione di lisi 10X (Promega) in modo da poter quantificare la massima quantità di LDH rilasciato;

d) Background del mezzo di crescita, dal momento che sia il FBS che il rosso fenolo

(presente come indicatore di pH nel terreno DMEM) contribuiscono al valore di assorbanza registrato a 490 nm;

e) Controllo di correzione del volume, dovuto all’aggiunta della soluzione di lisi nel

controllo di rilascio massimo di LDH da parte delle cellule target (c).

! Figura 2.6: Rappresentazione schematica della micropiastra utilizzata nel saggio di citotossicità e della

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Al termine dell’incubazione la micropiastra veniva centrifugata per 4 minuti a 250 x g e 50 µl del sovranatante erano trasferiti in una nuova micropiastra da 96 pozzetti con fondo piatto (Corning Incorporated). Come indicato dal protocollo del kit utilizzato, l’Assay Buffer conservato a -20°C, era scongelato e 12 ml venivano trasferiti alla polvere di Substrate Mix. Erano aliquotati 50 µl di reconstituted Substrate Mix in ogni pozzetto contente il sovranatante. La micropiastra veniva incubata al riparo dalla luce per 30 minuti, al termine dei quali venivano aggiunti 50 µl di Stop Solution allo scopo di bloccare la reazione enzimatica. L’assorbanza alla lunghezza d’onda di 495 nm era misurata per ciascun pozzetto tramite lettore ELISA (BioRad).

Per ogni ceppo utilizzato e per ogni controllo veniva calcolato il valore medio dell’assorbanza. A ciascun valore medio veniva successivamente sottratto il valore medio del background del mezzo di crescita (controllo d) e infine la percentuale di citotossicità era calcolata attraverso la formula sottostante:

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