3.1) Scopo dello studio
Lo scopo che questo studio si prefigge è quello di indagare i valori di pH, pCO₂, cK⁺, cNa⁺, cCa⁺⁺, cCl⁻, cGlu, cLac, mOsm, cBase, cHCO₃⁻, ctCO₂ ed Anion Gap per la T. hermanni. Tale esigenza nasce da molteplici fattori: il fatto che quello dell'emogasanalisi sia un campo in grande fase di sviluppo in medicina veterinaria, sempre più utilizzato anche nella pratica clinica quotidiana, specialmente nei reparti di terapia intensiva e medicina d'urgenza; il fatto che sia quasi totalmente inesplorato per la medicina dei cheloni, specialmente per le specie terrestri, unito al fatto che T. hermanni, oltre ad essere una delle specie maggiormente rappresentata sul nostro territorio, è considerata vicino allo status di vulnerabilità per la “IUCN Red Lst of Threatened Species”, secondo la quale questo chelone rientra nella fascia di animali a rischio di minaccia di estinzione soprattutto perché ha un trend di popolazione selvatica in calo. Questo studio si prefigge quindi diversi obiettivi: in primis fornire nuove ed aggiornate informazioni riguardo alla fisiologia di T. hermanni; queste ultime possono risultare utili sia per ulteriori indagini riguardanti questa branca della fisiologia dei cheloni, fino ad oggi poco studiata, oltre a poter essere d'aiuto nella pratica clinica quotidiana, fornendo nuove informazioni al medico veterinario ed aiutando a creare il quadro più completo possibile delle reali condizioni di ogni paziente. Le informazioni raccolte possono inoltre essere utilizzate come base per ulteriori studi volti a determinare dei range di riferimento di specie per i parametri considerati, e si prefiggono di divenire uno strumento nell'ampliare le conoscenze mediche riguardo ad una specie vicina alla minaccia di estinzione, aiutandone la conservazione.
3.2) Materiali e metodi
3.2.1) Soggetti: criteri di inclusione
Durante la realizzazione di questo studio sono stati identificati dei rigidi criteri per l'inclusione dei soggetti all'interno del protocollo adottato, in modo tale da garantire la maggior omogeneità possibile e soprattutto in modo da ottenere i valori più rappresentativi dello standard per la T. hermanni.
Per poter rientrare nel protocollo i requisiti erano i seguenti: gli esemplari dovevano essere delle T. hermanni; i soggetti dovevano condurre una vita all'aperto, eseguendo correttamente il letargo; i soggetti dovevano essere adulti in età riproduttiva; i soggetti dovevano avere un peso minimo di 450g ed una lunghezza curva del carapace minima di 15cm; i soggetti dovevano essere correttamente registrati e dotati di microchip identificativo; tutti i soggetti dovevano essere giudicati sani sulla base di un esame clinico. Inoltre lo studio si prefiggeva di includere esemplari appartenenti ad entrambi i sessi, nel numero minimo di quaranta esemplari.
3.2.2) Prelievo e preparazione del campione
Prima di procedere con il prelievo sui soggetti che avevano tutti i requisiti per essere inclusi nello studio è stato necessario prepararsi adeguatamente ad eseguire l'emogasanalisi nel modo più veloce possibile, oltre che a determinare il miglior protocollo a fine di ridurre al minimo gli errori preanalitici ed analitici. Come è stato già illustrato precedentemente è stata preparata una siringa da 1ml per effettuare il prelievo: la scelta del tipo di siringa è stata dettata dalla quantità di sangue che doveva essere prelevato, minore di 1ml, e dalla volontà di ridurre al minimo lo spazio morto all'interno della siringa stessa; prima della procedura di prelievo sono stati eseguiti tre cicli di eparinizzazione, consistenti in aspirazione di una soluzione contenente eparina e successiva espulsione della stessa. Durante questa manovra lo stantuffo è stato portato alla sua massima escursione, in modo da bagnare con la soluzione eparinata la maggior superficie possibile della siringa;
a seguito dei tre cicli di aspirazione ed espulsione è stato effettuato un ulteriore aspirazione a vuoto, in modo poi da espellere tutta l'aria contenuta nella siringa insieme all'eccesso di soluzione eparinata, mantenendo soltanto una piccola rimanenza all'interno del cono della siringa. Per effettuare il prelievo con maggiore facilità è stato sostituito all'ago della siringa da 1ml un ago grigio, più adatto a raggiungere il sito di prelievo, il quale è stato piegato circa di 45 gradi in modo da rendere la manovra più agevole.
Il sangue è stato raccolto dal seno cervicale dorsale: tale sito di prelievo consta nell'anastomosi dei vasi intercostali prima che questi si uniscano a loro volta alla vena giugulare esterna. Non è possibile visualizzare i vasi da cui prelevare il sangue, quindi per effettuare il prelievo è necessario sapere dove questi sono collocati, cioè lungo la linea mediana del carapace, inferiormente alla colonna vertebrale. La tecnica di prelievo consiste nell'inserire l'ago tra il collo dell'animale ed il margine del carapace, lungo l'asse mediano, applicare con lo stantuffo una lieve pressione negativa e procedere con l'ago fino a che non compare il sangue nel cono della siringa. Se viene raggiunta la colonna vertebrale è necessario tornare leggermente indietro, sempre applicando una lieve pressione negativa.⁽³³⁾⁽³⁴⁾
Qualora ci fosse stato il sospetto di una contaminazione da parte di linfa del campione di sangue prelevato, principalmente individuato dal colore opalescente e chiaro del contenuto della siringa, si procedeva a scartare il prelievo a sospetto di contaminazione ed a effettuarne uno nuovo.
A seguito del prelievo il sangue veniva privato delle bolle e rimanenze di aria al suo interno e portato immediatamente nel reparto di terapia intensiva, dove veniva processato dall'emogasanalizzatore entro cinque minuti dal momento del prelievo.
3.2.3) Metodo analitico
I campioni raccolti sono stati processati entro 5 minuti dal campionamento tramite un emogasanalizzatore Radiometer ABL 700™. La siringa contenente il campione è stata posizionata nell'apposito sportello ed è stata avviata la procedura di analisi.
Mentre l'emogasanalizzatore procedeva al prelievo del sangue dalla siringa venivano aggiunti nel computer integrato all'apparecchio i dati necessari per la corretta valutazione e registrazione dei valori; nella fattispecie venivano inseriti razza, proprietario, temperatura del soggetto al momento del prelievo, tipo di prelievo e pannello da effettuare. A seguito dell'inserimento dei dati l'analizzatore procedeva con l'analisi e visualizzava i risultati sullo schermo del computer; si procedeva quindi alla stampa dei risultati ed all'eliminazione della siringa con ogni rimanenza di sangue.
3.2.4) Test statistici
I dati raccolti sono stati analizzati mediante il programma di calcolo Statgraphics Centurion™. È stato usto il test Shapiro-Wilk W e sono state valutate l'asimmetria standardizzata e la curtosi standardizzata per indagare il tipo di distribuzione dei dati.
L'asimmetria descrive la distribuzione della variabile studiata rispetto all'asse mediano: generalmente, per una distribuzione normale, l'asimmetria è zero; se l'asimmetria è positiva o negativa significa che una parte maggiore dei dati è distribuita a sinistra o a destra della linea mediana. Si considera una distribuzione come normale se i valori di asimmetria sono compresi tra +2 e -2.⁽³⁵⁾
La curtosi è la misura dei picchi descritti dalla distribuzione studiata; se i valori di curtosi standardizzata sono compresi nell'intervallo che va da -2 a +2 la distribuzione può essere considerata normale.
Il test Shapiro-Wilk W è un test ideato per verificare delle ipotesi statistiche, in particolare la distribuzione normale di un insieme di dati. Viene considerato attendibile soprattutto per piccoli campioni e si basa sul confronto di due differenti stime della varianza: uno stimatore non parametrico al numeratore ed uno invece parametrico al denominatore. Il primo è basato sulla combinazione lineare ottimale della statistica d'ordine di una variabile aleatoria, mentre il secondo è la varianza del campione. Viene quindi calcolato il valore W mediante il rapporto appena descritto, il quale può assumete valori che spaziano tra 0 ed 1;
in base alla grandezza del valore W si può rifiutare o meno l'ipotesi nulla, cioè che i dati analizzati abbiano una distribuzione normale. Il valore cut-off per il rifiuto dell'ipotesi nulla è 0,05: per valori W inferiori non si può assumere che i dati studiati abbiano una distribuzione normale, mentre per valori W superiori a tale soglia possiamo invece assumere una distribuzione normale.⁽³⁷⁾
I dati hanno subito un'ulteriore analisi per riuscire a delineare eventuali outliers, cioè dei valori che non seguono la normale distribuzione del resto dei campionamenti; per effettuare tale ricerca è stato applicato il Tukey test.⁽³⁶⁾ Sono stati individuati outliers sono nei valori dell'Anion Gap, in numero di uno.
È stato quindi possibile calcolare i valori di riferimento sia per i valori con distribuzione normale, tramite il calcolo di media ±2 deviazioni standard, le quali individueranno il limite superiore ed il limite inferiore, sia per i valori con distribuzione non normale, tramite il metodo dei percentili, il quale consiste nel calcolare la mediana ed i percentili e considerare solo il 95% della distribuzione centrale dei valori, scartando cioè i valori inferiori al percentile 0,025 e superiori al percentile 0,975.
Oltre alle analisi sopra descritte è stato effettuato anche il test non parametrico di Mann-Whitney U, al fine di evidenziare eventuali differenze tra i valori nel primo periodo di prelievo, a fine Luglio, e quelli del secondo periodo, a fine Settembre. Tale indagine risulta opportuna in quanto è già noto come alcuni metaboliti abbiano oscillazioni stagionali in questa specie di chelone.⁽³⁸⁾
Gli intervalli di riferimento ottenuti sono stati comparati con quelli presenti in letteratura per T. hermanni e, qualora non fosse stato possibile per mancanza dei valori di confronto, sono stati comparati con altri valori relativi ad altre specie di cheloni o coi valori attesi per la classe reptilia. I dati ottenuti sono stati confrontati, oltre che con fonti esterne, anche tra loro, per ricercare eventuali discrepanze tra i valori ottenuti nella prima sessione di prelievi rispetto alla seconda, a causa delle note oscillazioni stagionali di alcuni analiti nei cheloni.⁽³⁸⁾ ⁽⁴³⁾