CAPITOLO 1: EMOGASANALISI
1.6 Intervalli di riferimento
Un intervallo di riferimento viene definito come tutti i valori compresi tra un limite superiore ed un limite inferiore, limiti compresi; tali limiti sono definiti in modo tale che l'intervallo di riferimento contenga il valore reale proveniente da una popolazione di riferimento, con un margine di certezza ragionevole, generalmente del 95%. Una popolazione di riferimento viene definita come un numero non precisato di individui che rappresenta la parte di popolazione per la quale l'intervallo di riferimento sarà usato.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
commissionati per la prima volta nel 1970 dall'International Federation of Clinical Chemistry IFCC, ed in seguito revisionati dal Clinical and Laboratory Standard Institute nel 2008. L'American Society for Veterinary Clinical Pathology ha dapprima incoraggiato i medici veterinari ad utilizzare le stesse linee guida, per poi creare essa stessa una serie di linee giuda per la determinazione di intervalli di riferimento ex novo per le specie di interesse veterinario.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
Il metodo per stabilire intervalli di riferimento ex novo comprende tre fasi: una fase pre analitica, una fase analitica ed una fase post analitica. La fase preanalitica comprende la scelta della popolazione di riferimento ed il campione di individui di riferimento, la stima o il calcolo del numero dei soggetti inclusi, stabilire il metodo analitico da utilizzare ed infine la standardizzazione dei metodi di raccolta dei dati e di manipolazione di soggetti e campioni.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
La scelta della popolazione di riferimento può seguire tre criteri: a priori, cioè vengono prima stabiliti dei criteri di inclusione nello studio, basati su quali siano le caratteristiche ritenute necessarie per rappresentare un individuo considerato sano della popolazione studiata; a posteriori, il quale prevede la raccolta di numerosi campioni, i quali verranno poi analizzati per capire quali possano essere utilizzati per calcolare gli intervalli di riferimento; ed infine col metodo indiretto, attingendo cioè ad un database preesistente e raccogliendo da li i dati necessari a stabilire i valori ricercati.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
La stima del numero dei soggetti inclusi è necessaria per capire quale tipo di analisi statistica sia opportuno applicare. Il metodo analitico deve essere ben definito, in modo da ridurre al minimo il rischio di un errore preanalitico, e quindi deve essere standardizzato, in modo anche da garantire la possibilità di revisionare il lavoro svolto e valutarne l'attendibilità.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
La fase analitica prevede l'esecuzione di tutti i protocolli decisi nella fase preanalitica, facendo attenzione anche ad effettuare i regolari controlli di qualità delle apparecchiature del laboratorio.
La fase post analitica prevede la realizzazione di istogrammi con i quali procedere allo studio dei dati raccolti. Tramite gli istogrammi è possibile quindi identificare ed escludere gli outlier: questi sono valori anomali rispetto al resto dei
campionamenti, per problemi come uno stato patologico non diagnosticato del soggetto campionato o per un malfunzionamento delle apparecchiature usate per l'analisi; tali outlier devono essere eliminati, in modo da poter stabilire con efficacia l'intervallo di riferimento: per farlo è possibile utilizzare test come il Dixon's Range o l'algoritmo di Horn con le restrizioni degli interquantili di Tukey. ⁽¹⁶⁾
Dopo l'identificazione e l'eliminazione degli outlier si procede con la valutazione della distribuzione dei dati, mediante test statistici come l'Anderson-Darling, il Kolmogorov-Smirnov o il Shapiro-Wilk. Una volta stabilita la distribuzione è possibile calcolare gli intervalli di riferimento, utilizzando metodi che possono essere parametrici, non parametrici od il metodo robusto. I metodi parametrici possono essere utilizzati se il numero di campioni è di 40-120 o superiore e la distribuzione risulta essere normale. Viene calcolata la media e le deviazioni standard e tramite queste vengono stabiliti il limite superiore ed il limite inferiore. I metodi non parametrici vengono utilizzati quando la distribuzione risulta non normale ed il numero di campioni è maggiore di 120: permettono di ottenere mediana e percentili 2,5% e 97,5%, i quali corrispondono al limite inferiore ed al limite superiore. Il metodo robusto si applica invece quando sono pochi i dati a disposizione, quindi i campioni risultano tra i 20 ed i 40: si basa sulla trasformazione logaritmica dei dati e successiva elaborazione tramite indicatori robusti.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
Dopo la determinazione degli intervalli di riferimento è necessario calcolare gli intervalli di confidenza, i quali forniscono una stima dell'incertezza del limite inferiore e superiore; gli intervalli di confidenza sono tanto minori quanto il numero dei campionamenti è elevato, e se il loro valore eccede di 0,2 volte o più l'ampiezza dell'intervallo di riferimento è consigliabile raccogliere ulteriori campioni prima di procedere.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾
Esistono anche altri metodi per la determinazione degli intervalli di riferimento: metodo degli intervalli di riferimento comuni, il metodo di trasferimento e validazione di intervalli di riferimento da fonti esterne ed il metodo di determinazione degli intervalli di riferimento basato su singoli soggetti.
Il metodo degli intervalli di riferimento comuni è simile a quello della determinazione ex novo, con la sola differenza che invece di essere calcolati per un singolo laboratorio sono calcolati per un gruppo di laboratori presenti nella stessa area. I vantaggi sono molteplici: il numero dei campioni a disposizione aumenta considerevolmente, rendendo i calcoli più agevoli e le stime più accurate, fornisce una linea guida per i valori analizzati su una vasta area invece che per un singolo laboratorio; come svantaggi invece possiamo annoverare la difficoltà di standardizzare e monitorare tutte le procedure che avvengono contemporaneamente in diversi laboratori ed effettuate da personale diverso. Il metodo di trasferimento e validazione di intervalli di riferimento da fonti esterne consiste nella verifica degli intervalli di riferimento ottenuti da un altro laboratorio per poi poterli utilizzare. Il primo passo consiste nell'analizzare i protocolli con i quali sono stati ottenuti gli intervalli di riferimento dalla fonte esterna, in modo tale da valutarne l'efficacia ed il rigore; in seguito si procede alla validazione per il laboratorio usando il metodo diretto oppure il metodo rigoroso. Il metodo diretto consiste nella comparazione degli intervalli di riferimento con 20 campionamenti, selezionati in modo che i dati siano omogenei e senza la presenza di outlier; se i dati che non rientrano nei valori di riferimento sono 0-2, tali range sono validati; se i dati che non rientrano negli intervalli sono più di 4 tali intervalli non sono convalidati; se i valori non compresi sono 3-4 è necessario ripetere il procedimento con altri 20 campioni. Il metodo rigoroso invece prevede l'utilizzo di test come il Mann-Whitney U test, il Median test od il Siegal-Tukey test. Affinchè la comparazione abbia un significato statistico il numero di campioni da utilizzare dovrebbe essere compreso tra 40 e 60 per effettuare questo metodo.⁽¹⁶⁾
Il metodo di determinazione degli intervalli di riferimento basato su singoli soggetti viene utilizzato quando la variabilità intra individuale è minore della variabilità inter individuale per il valore in oggetto, e si basa sulla determinazione degli intervalli di riferimento basandosi sui dati di un soggetto, i quali vengono poi valutati mediante l'utilizzo dell'indice di individualità, per capire se sono oggettivamente utili oppure no.⁽¹⁶⁾
Qualunque metodo venga utilizzato per determinare gli intervalli di riferimento, è necessaria un'attenta documentazione di tutti i protocolli attuati e di tutte le misurazioni e procedure effettuate, in modo tale che possa essere in seguito valutato scientificamente il lavoro svolto.⁽¹⁶⁾⁽¹⁷⁾