DIAGNOSI BIOMOLECOLARE

I metodi molecolari rappresentano una valida alternativa all' isolamento. Viste le difficoltà associate a queste tecniche, negli ultimi anni si sono sviluppate altre metodiche di rilevazione diretta di DNA. Le possibilità di diagnostica per clamidia sono notevolmente migliorate con l'introduzione delle metodiche biomolecolari, in particolare con la PCR (Polymerase Chain Reaction), che permette l'identificazione diretta da campioni clinici e di ridurre i tempi di diagnosi. La principale caratteristica di questa metodica è l'elevata sensibilità. Le diverse tecniche di PCR sono state comparate in molti studi con altri metodi diagnostici e al momento è la più sensibile e specifica. Questa metodica è comunemente utilizzata nella diagnosi di clamidiosi aviare, sia ante-mortem, che post mortem, ma anche da colture cellulari o uova embrionate. Si possono analizzare tamponi clinici da cloaca, coana, congiuntiva oppure deiezioni

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come pool di almeno 3 giorni, meglio se 5-7 giorni, poiché l' eliminazione di clamidia è intermittente e questo permette di individuare il soggetto portatore. Diverse metodiche e protocolli sono riportati in letteratura.

Alcuni comprendono tutte le specie di clamidia, ad esempio utilizzando come target la regione genica RNA ribosomiale 16S-23S rRNA, altre hanno come target il gene ompA per l'amplificazione (Hewinson, 1997; Everett, 1999; Geens et al., 2005b). Quest'ultimo gene, che codifica per la MOMP, ha 4 Variable Domains (VDI-IV) e 5 regioni conservate. Mentre i determinanti antigenici specie specifici e gene specifici sono codificati dalle regioni conservate, i segmenti serovar specifici sono posizionati principalmente nella VDII e VDIV. Questa sua struttura lo rende ideale come target per PCR diagnostiche (Sachse et al., 2005). Altri target genomici riportati sono rappresentati da ompB, 16S RNA, pmp gene family.

Hartley et al., 2001, proposero un protocollo di PCR con target il gene ompB che ha permesso di identificare molte delle specie di clamidia.

La PCR è una metodica di prima scelta per la sua rapidità, sensibilità, specificità, rapporto costo- beneficio, e facilità poichè che richiede un campionamento semplice, minimo, e identifica anche piccole quantità di clamidia. La tecnica di PCR classica può essere utilizzata come screening, però non differenzia tra microrganismo vivo e morto, quindi un risultato positivo va interpretato alla luce dei segni clinici o di altri strumenti diagnostici. Anche PCR di tipo nested (Sachse e Hotzel, 2003) e PCR Real Time sono state messe a punto. La nested per esempio permette di differenziare C. psittaci, C. trachomatis, C. pneumoniae (Messmer et al., 1997). Il vantaggio della Real Time è rappresentato dal fatto che è una tecnica quantitativa, più rapida e specifica, e permette il rilievo e quantificazione dei diversi genotipi senza necessitare di RFLP e sequenziamento e delle attività post-amplificazione (Geens et al., 2005b; Pantchev et al., 2009; Pantchev et al., 2010).

Protocolli di Real Time PCR hanno come bersaglio sia sequenze genomiche conservate delle Chlamydiaceae (Everett et al., 1999, DeGraves et al., 2003; Ehricht et al., 2006) sia sequenze genomiche specie-specifiche e genotipo specifiche di C. psittaci (Geens et al., 2005b; Pantchev et al., 2009; Pantchev et al., 2010).

Okuda et al., 2010, hanno recentemente sviluppato una metodica di PCR Real Time basata su SYBR Green da feci, e sembra che questa metodica sia più sensibile e non sia influenzata da inibitori presenti nelle feci a differenza della PCR classica. Inoltre è one step per cui non sono necessarie le procedure di manipolazione del campione dopo la reazione di PCR, come l'elettroforesi, riducendo il rischio delle possibili contaminazioni da amplificato e quindi i falsi positivi.

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Oltre alla sierotipizzazione, una procedura di genotipizzazione di C. psittaci consistente in analisi di restrizione enzimatica dell'amplificato di PCR (RFLP-PCR), è stata introdotta per tipizzare i ceppi di C. psittaci, mostrando alta concordanza con la sierotipizzazione, anche se occasionalmente i risultati non sono stati corrispondenti (Sayada, 1995). Questa metodica può essere applicata direttamente a campioni clinici. D'altro canto rispetto ad altri metodi di genotipizzazione la RFLP-PCR non è altamente sensibile se non è presente una quantità sufficiente di DNA da amplificare nel campione di partenza. A volte è necessaria una seconda digestione enzimatica con MboII, in seguito alla prima con AluI. Inoltre, tale metodica non è stata in grado di riconoscere il nuovo genotipo E/B o altri ceppi di C. psittaci atipici (Geens et al., 2005a; 2005b).

Questo nuovo genotipo è stato recentemente descritto da Geens et al., (2005a) grazie al sequenziamento dell'ompA. Analisi di sequenza dell'ompA sono state suggerite particolarmente nei casi dove la sierotipizzazione e la RFLP PCR non sono in grado di fornire risultati conclusivi. Le metodiche sierologiche, RFLP e Real Time, non sono in grado di discriminare tra tutti i genotipi e di identificare nuovi genotipi.

Recentemente, in Germania, Sachse et al., nel 2005, hanno sviluppato una tecnologia innovativa biomolecolare basata su DNA microarray utilizzando il sistema Array Tube della AlereTM

per l'identificazione e la differenziazione in genotipi dei ceppi isolati di clamidia (figura 5-6), e potenzialmente applicabile direttamente a campioni clinici (Borel et al., 2008; Sachse et al., 2009a; 2009b). In particolare sono presenti 28 sonde specie specifiche, 3 sonde genere, 5 sonde di specie vicine al genere Chlamydia (Simkania negevensis, Waddlia chondrophila) e sono compresi i 9 genotipi di C. psittaci più i nuovi ceppi. Diversi pattern ibridazione specie-specifici sono letti da un software permettendo l'identificazione dei diversi genotipi, fornendo informazioni aggiuntive rispetto alla PCR classica.

Esistono due tipi di DNA microarray, uno che ha come target il gene 23S rRNA della famiglia Chlamydiaceae e permette l'identificazione di specie (Sachse et al., 2005). Mentre l'altro è stato specificatamente sviluppato per la genotipizzazione di C. psittaci basata sulla sequenza dell'ompA (Sachse et al., 2008) in particolare mediante ibridazione con 35 sonde, derivate dai domini variabili II e IV del gene ompA, in grado di discriminare tra sette genotipi aviari (A, B, C, D, E, F, E/B) e due non aviari (WC e M56).

Uno studio di validazione ha recentemento comparato diverse metodiche, riportando che la sensibilità di Real Time PCR e microarray si è dimostrata equivalente. Questi ultimi rappresentano una metodica più rapida e hanno una maggiore specificità. La loro specificità, che permette il rilievo di un singolo polimorfismo nucleotidico, è dovuto all'approccio che consiste

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nell'uso di 35 sonde oligonucleotidiche di ibridizzazione derivate dai domini variabili 2 e 4 del gene ompA.

Inoltre sono in grado di evidenziare anche infezioni miste (Borel et al., 2008).

Figura 5. Pattern di ibridizzazione dei nove

genotipi di C. psittaci, spot diversi in base al tipo di ibridazione con le sonde (Sachse et

al., 2008).

Figura 6. http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions/platform-components/array-tube-at.html

Sistema denominato Array Tube (AT), per analizzare DNA arrays ad alta e bassa densità. Gli AT sono costituiti da dei chips delle dimensioni di circa 3mm X 3 mm (area attiva 2,4 mm X 2,4 mm), sui quali sono depositate o sintetizzate in situ le sonde di DNA, collocati sul fondo di una provetta di 1,5 ml. Diversamente da altri sistemi

microarray, le fasi di ibridazione e rilevazione del segnale sono facili da realizzare senza l'impiego di

strumentazione particolare come camere di ibridazione. Il segnale di ibridazione è prodotto da un sistema di catalisi enzimatica non fluorescente ed è sufficiente un lettore a luce trasmessa per monitorare la formazione degli ibridi attraverso la misura cinetica della precipitazione per ogni punto, grazie ad una CCD (Charged Coupled Device) camera integrata.

Oltre alla classificazione di C. psittaci basata sulla sequenza del gene ompA, un nuovo approccio basato su MLVA (Multiple Locus Variable Number of Tandem Repeats Analysis) è stato recentemente applicato da Laroucau et al., 2008, che hanno sviluppato una tecnica in grado di tipizzare ulteriormente gli isolati di C. psittaci. MLVA è una tecnica di tipizzazione molecolare basata sull'amplificazione dei VNTR (Vergnaud e Pourcel 2009), sequenze polimorfiche di DNA ripetute in tandem all'interno del genoma di C. psittaci, che possono essere utilizzate come marker per la discriminazione di genotipi differenti. I VNTR sono già stati utilizzati in passato

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per tipizzare molti patogeni tra i quali possiamo ricordare Mycobacterium tuberculosis (Le Fleche et al., 2002), Bacillus anthracis (Le Fleche et al., 2001), Yersinia pestis (Pourcel et al., 2004).

Nell'analisi MLVA un numero selezionato e caratterizzato, in termini di mutazioni, di loci vengono amplificati con PCR in modo tale da misurare la lunghezza di ciascun locus. Dalle dimensioni di ciascun locus si può dedurre il numero di ripetizioni.

Per quanto riguarda la caratterizzazione di C. psittaci, sono stati individuati otto VNTR polimorfici sul ceppo aviario di riferimento 6BC (ChlaPsi_280, ChlaPsi_480, ChlaPsi_605, ChlaPsi_810, ChlaPsi_222, ChlaPsi_281, ChlaPsi_929 e ChlaPsi_1778) che permettono di discriminare 20 genotipi. Il DNA dei campioni in esame viene sottoposto ad uno screening iniziale attraverso una Real Time PCR disegnata sul 23S rRNA e successivamente a Real Time PCR specie-specifiche per la discriminazione tra C. psittaci, C. abortus e C. pecorum (Pantchev et al., 2009). Le sequenze dei primer e delle sonde per queste tre specie sono state disegnate su regioni del gene ompA. I campioni che risultano positivi per C. psittaci sono ulteriormente tipizzati in una multiplex PCR utilizzando otto coppie di primer, ciascuna corrispondente ad uno dei VNTR prescelti per l’analisi in MLVA. I prodotti di amplificazione sono separati per elettroforesi su gel d’agarosio e la dimensione di ciascun frammento permette di dedurre il numero di unità ripetute del singolo locus. Il bandeggio ottenuto viene confrontato con i pattern dei ceppi rappresentativi per C. psittaci tipizzati presso il laboratorio francese e dalla combinazione degli otto VNTR si ottiene un profilo di MLVA ascrivibile ad un genotipo. Tuttavia, per mettere in correlazione il pattern identificato con uno dei serovar di norma classificati con anticorpi monoclonali, è necessario effettuare un’ulteriore analisi PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) su una regione altamente conservata del gene ompA, seguita da digestione enzimatica con AluI e MboII (Vanrompay et al., 1997). Il profilo di restrizione viene confrontato con i pattern di riferimento in modo da completare l’analisi di genotipizzazione. In alcuni casi, non è stato possibile ottenere una correlazione chiara tra il profilo MLVA e il sierotipo, come nel caso del genotipo E/B recentemente caratterizzato che presenta lo stesso pattern MLVA del genotipo C.

Analisi comparative tra MLVA, sierotipizzazione e ompA indicano che MLVA è in grado di discriminare 20 patterns.

Molti dei ceppi di genotipo A hanno mostrato un pattern 12, mentre molti dei ceppi di genotipo B ed E hanno mostrato un pattern 7. Finora gli isolati di piccione hanno mostrato quattro differenti pattern 1,7, 12, 19.

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MLVA può essere utilizzata come metodo molto sensibile di tipizzazione per evidenziare le diversità molecolari tra i ceppi di C. psittaci di diverse specie ospiti e origine geografica per futuri studi epidemiologici, oltre che essere eseguibile direttamente da DNA estratto di campione clinico.