DIAGNOSI SIEROLOGICA

La sola sierologia è utile per studi sieroepidemiologici piuttosto che diagnostici, non è di ausilio e non è sufficiente per la diagnosi di clamidiosi in campo aviare per l'elevata sieroprevalenza e diffusione in tutte le specie di uccelli e per la persistenza fino a molti mesi degli anticorpi. Deve essere sempre abbinata a tecniche dirette per rilevare l’infezione da clamidia.

Un esame sierologico positivo indica che il soggetto si è infettato (è venuto in contatto con clamidia) ma non indica una infezione in corso (in atto), per la cui diagnosi è necessario mettere in evidenza l’incremento del titolo anticorpale.

Falsi negativi si possono verificare in uccelli con infezione acuta, prelevati prima della sieroconversione che quindi non hanno ancora prodotto anticorpi, o sottoposti a trattamento antibiotico. I trattamenti antibiotici possono infatti ritardare o diminuire la risposta anticorpale. Le IgG possono persistere anche dopo un trattamento efficace. Le tecniche sierologiche in uso che permettono di identificare gli anticorpi sierici specifici per la clamidiosi sono, FDC, agglutinazione dei corpi elementari, agglutinazione al lattice, ELISA. Tra i test sierologici utilizzati su larga scala ritroviamo la FDC, che tende ad essere sostituita da test ELISA rapidi commerciali.

Originariamente descritta da Bedson, 1935, la fissazione del complemento è tra le metodiche più comunemente utilizzate per rilevare gli anticorpi (Anticorpi diretti contro l'LPS). La porzione immunodominante dell'antigene, che contiene carboidrati, stimola la formazione di anticorpi fissanti il complemento. Rappresenta una metodica poco sensibile, ma di facile esecuzione ed è per questo motivo che è la più utilizzata su larga scala come indicatore di avvenuta infezione in un gruppo di uccelli. Permette la rilevazione di anticorpi 7-10 giorni dopo l’infezione. I trattamenti antibiotici, come precedentemente accennato, possono però ritardare o impedire il rialzo anticorpale. E' in grado di rilevare IgG e non IgM, la concentrazione di IgG tende ad aumentare più tardi nel corso dell'infezione e a persistere per mesi o anni (Grimes 1993). In alcune specie di pappagalli di piccola taglia quali, ondulati, inseparabili, parrocchetti, giovani cenerini, può risultare falsamente negativa. Normalmente titoli elevati, maggiori di 1:64 o più

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alti, sono indicativi di una infezione recente o intercorrente, anche se la soglia di positività per FDC riportata nel Manuale OIE è pari a 1:32. Solo un aumento del livello anticorpale di quattro volte tra due prelievi di siero viene considerato diagnostico ed indicativo di una infezione recente o della malattia in corso. Questo fattore comporta un ulteriore limite della metodica in quanto si ha un allungamento dei tempi di risposta laboratoristici. Alti titoli possono persistere anche dopo che il trattamento antibiotico è terminato e questo può complicare l'interpretazione dei risultati. La FDC si è rilevata efficace nel tacchino (Hall et al., 1974), negli uccelli selvatici (Grimes e Page, 1978) e nei pappagalli (Grimes, 1985), e può essere utilizzata per esaminare sieri di piccione come raccomandato da Page (1975).

Rileva solo anticorpi capaci di fissare il complemento e diretti verso un antigene di gruppo specifico, mentre altre metodiche sierologiche sono in grado di rilevare tutte le IgG capaci di legare l'antigene (Salinas, 1993). Poiché gli uccelli producono principalmente anticorpi non fissanti il complemento, è stata messa a punto la fissazione del complemento modificata. La FDC modificata si ottiene aggiungendo siero fresco di pollo al complemento, ottenendo un aumento della sensibilità della tecnica (Grimes e Page 1978; Manuale O.I.E.) in modo tale da poter usare questa metodica per testare sieri di specie aviari i cui anticorpi non fissano normalmente il complemento di cavia. Il complemento di cavia è risultato incompatibile con il siero di molte specie aviarie (Grimes, 1984), i piccioni però fissano il complemento di cavia a differenza di tacchini e certe specie di pappagalli.

La FDC modificata è più sensibile (Grimes e Page 1978; Salinas e Caro 1993). Inoltre è più sensibile dei metodi di agglutinazione, quali Agglutinazione al lattice (Grimes et al., 1993) metodica in grado di rilevare IgG ma anche IgM. Poco utilizzata, anche se semplice, rapida e specifica, è poco sensibile rispetto alla FDC, si possono presentare falsi negativi, con variazione di soglia di positività in base alle specie.

L'agglutinazione dei corpi elementari (Grimes, 1994), invece, mette in evidenza le IgM, quindi infezioni recenti o correnti. Titoli maggiori di 1:10 in ondulati e calopsitte e inseparabili, e maggiori di 1:20 in volatili di taglia grande si riscontrano di frequente in infezioni recenti. Metodica considerata sensibile solo in certi pappagalli, mentre nei piccioni non è considerata tale e la FDC è raccomandata (Phalen et al., 1999).

Nel piccione, ELISA, Immunofluorescenza indiretta, microimmunofluorescenza, sono usate meno frequentemente. In queste specie, Milon (1983) e Trap (1896) hanno comparato l'Immunofluorescenza indiretta e la FDC, dimostrando che la prima è più sensibile. Eidebenz (1990) ha dimostrato che l'ELISA competitiva (sarebbe elisa blocking antibodies) è più sensibile e specifica di FDC.

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Salinas (1993) ha comparato cinque metodiche sierologiche nel siero di piccione. In particolare, mantenendo immunofluorescenza indiretta come metodo di riferimento, ELISA e MIF sono risultati più sensibili di FDC, e la metodica ELISA meno specifica delle altre.

Infine, Ceglie et al., nel 2007, hanno riportato una buona concordanza tra FDC e microimmunofluorescenza, con riscontro di maggiori campioni positivi con quest'ultima metodica.

6.5. COLORAZIONI

6.5.1. Esame microscopico

Le clamidie (CE) possono essere evidenziate con vari metodi di colorazione quali il metodo Castaneda in blu ed in rosso con il metodo Macchiavello, oltre che con colorazione di Giménez, Giemsa, Castaneda (Macchiavello, 1937; Giménez, 1964; Quinn et al., 1994). La colorazione può essere effettuata su vetrino per impressione d’organo da fegato, milza, rene, polmone, pericardio, o in strisci di essudati o deiezioni. Le colorazioni più comunemente utilizzate sono Giemsa e Giménez. Quest'ultima insieme alla Giménez modificata (Andersen e Tappe 1989) viene utilizzata di routine in molti laboratori per individuare le inclusioni di clamidia in vetrini per impronta di sacco vitellino. Nonostante siano tecniche molto rapide e poco costose, presentano dei limiti in termini di bassa sensibilità e specificità, utili nel caso di grave infezione o nel picco d’infezione di clamidia, da utilizzare in uccelli che mostrano sintomatologia clinica ma non come metodiche di screening (Arizmendi e Grimes, 1995). I corpi elementari molto piccoli, 0,3 µm, perdono le caratteristiche morfologiche, il che li rende molto difficili da evidenziare quando presenti in basso numero.

6.5.2. Colorazioni istochimiche

Le clamidie possono essere evidenziate negli strisci e nelle sezioni in paraffina di tessuti utilizzando le colorazioni di Gimenez, Gimenez modificata, Zielh-Neelsen modificata, Giemsa dopo fissazione in Bouin o Carnoy (Stamp et al., 1950), in cui è possibile evidenziare eterofili, molti linfociti e plasmacellule, e occasionalmente macrofagi-like contenenti corpi elementari intracitoplasmatici (Gerlach, 1994). Risultano quindi poco specifiche e possibili cross reazioni con altri batteri Gram negativi si possono verificare.

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6.5.3. Colorazioni immunoistochimiche

Le colorazioni immunoistochimiche rappresentano un metodo utilizzato per il rilievo di clamidie in preparati citologici o istologici. La colorazione può essere effettuata mediante immunofluorescenza o con immunoperossidasi (Andersen e Tappe 1989), attraverso l'utilizzo di anticorpi monoclonali specifici diretti contro l'antigene della clamidia, MOMP o LPS. Alcuni anticorpi monoclonali non sono in grado di individuare le clamidie fissate in formalina, inoltre alcuni anticorpi monoclonali specifici per l'antigene LPS e anche sieri policlonali sono in grado di reagire con alcuni ceppi di batteri Gram negativi. Risulta comunque più sensibile e specifica della istochimica ma richiede buona esperienza nell'interpretazione dei risultati.