Differenziamento in condizioni di ipossia

E’ stato già detto che la proteina CSB svolge un ruolo importante nella risposta cellulare all’ipossia, fungendo da regolatore negativo della via pro-apoptotica mediata da p53 e favorendo l’avvio di una risposta pro-sopravvivenza dipendente da geni come HIF-1. Per tale ragione, tenendo conto dei risultati ottenuti nelle precedenti condizioni di coltura, in cui le cellule erano state cresciute ad una concentrazione di ossigeno pari a circa il 20%, corrispondente alla normale concentrazione d’ossigeno atmosferica, abbiamo iniziato prime osservazioni per seguire i processi di crescita e differenziamento dei progenitori neuronali a basse concentrazioni di ossigeno, in modo tale da riprodurre la condizione di ipossia in cui si possono venire a trovare queste cellule in condizioni fisio-patologiche. Grazie ad un apposito incubatore per colture cellulari, le cellule sono state mantenute in un ambiente contenente l’1% d’ossigeno. In tali condizioni già dopo pochi giorni è stato possibile notare, che le cellule presentano un tasso di crescita molto più rallentato rispetto a quello osservato al 20% di ossigeno. Prima di arrivare a considerare una concentrazione di ossigeno così bassa rispetto al 20% in cui vengono cresciute la maggior parte delle linee cellulari in vitro, abbiamo preso in considerazione concentrazioni di ossigeno intermedie usate in esperimenti noti dalla letteratura; pur avendo condotto alcuni esperimenti usando una concentrazione di ossigeno pari al 5%, riportiamo gli esperimenti condotti all’1% di ossigeno perché sono quelli che hanno dato i risultati più significativi e interessanti nel nostro sistema cellulare.

Nella Figura 30 riportiamo le fotografie scattate con fotocamera digitale collegata al microscopio ottico a contrasto di fase, prese ad intervalli regolari, ogni tre giorni del processo di differenziamento sia per la linea ShK, che per quella shCSB, condotto all’1% di ossigeno.

Come si vede, in queste condizioni, né la linea difettiva per CSB, né la linea di controllo sembrano capaci di dare origine a quelle tipiche architetture che erano visibili in concentrazioni atmosferiche di ossigeno, quali cavitazioni, prolungamenti neuritici che prima formano una rete intricata, poi si raccolgono in fascicolazioni, e agglomerati di cellule. Tuttavia, anche in questo caso è possibile notare importanti differenze fra le cellule ShK e le cellule shCSB. Le cellule della linea 1, che fino al giorno 9 del differenziamento mantengono una forma insolitamente allargata, sviluppano poi dal giorno 12 molteplici ramificazioni e sembrano voler formare dei raggruppamenti che richiamano, anche solo vagamente, i grossi agglomerati visti al 20% di ossigeno.

Al contrario invece le cellule della linea 2 acquisiscono una forma notevolmente allargata e del tutto priva di prolungamenti o ramificazioni, molto diversa rispetto a quella che si presenta alla

116 concentrazione atmosferica d’ossigeno. Sembra quindi che la condizione di ipossia da noi indotta causi un generale rallentamento tanto nella proliferazione quanto nel differenziamento di questi progenitori neurali, colpendo in misura molto maggiore le cellule CSB difettive rispetto a quelle di controllo.

Fig.30: Serie di fotografie prese con fotocamera digitale collegata al microscopio ottico a contrasto di fase ogni tre giorni, durante il differenziamento in vitro in ambiente all’1% di ossigeno. La proliferazione cellulare appare generalmente rallentata in entrambe le linee cellulari e nessuna delle due popolazioni mostra le caratteristiche trasformazioni che avvengono durante la neurogenesi osservate al 20% di ossigeno. Le cellule di entrambe le linee presentano una morfologia allargata fin dall’inizio del differenziamento, ma successivamente le cellule ShK tendono a raggrupparsi e ad assumere un forma almeno stellata sena però emettere prolungamenti neuritici fino al 21° giorno. Le cellule shCSB, invece, anche nelle fasi avanzate del processo tendono a formare un tappeto di cellule notevolmente allargate, stipate le une accanto alle altre.

117 Nella Figura 31 riportiamo immagini affiancate, ciascuna relativa ad una delle due linee cellulari, per mettere in evidenza le notevoli differenze che si producono in condizioni di ipossia in fasi medio-avanzate del differenziamento sia nella morfologia cellulare che nell’organizzazione complessiva della popolazione.

Fig.31: Immagini prese al microscopio ottico a contrasto di fase con obiettivi 10X e 20X in due momenti critici del differenziamento condotto all’1% di ossigeno. Relativamente al giorno 13 sono riportate le immagine a due diversi ingrandimenti per meglio evidenziare le differenze morfologiche a livello cellulare e la diversa organizzazione della popolazione nel complesso. La popolazione CSB difettiva mostra un tasso di proliferazione profondamente ridotto rispetto alla popolazione di controllo come si deduce dalla densità cellulare e le cellule silenziate presentano un citoplasma insolitamente slargato, come si vede bene con l’obiettivo a maggior ingrandimento. Al giorno 24 anche le cellule di controllo non presentano un elevato grado di differenziamento come ci si attenderebbe in questa fase avanzata del processo, pure se sembrano darsi una sorta di organizzazione spaziale; le cellule silenziate invece mantengono ancora la loro forma allargata senza segni benché minimi di polarizzazione o riorganizzazione spaziale le une rispetto alle altre.

118 Intorno al 13° giorno del differenziamento, come si può dedurre osservando la densità cellulare, le cellule della linea CSB difettiva presentano un tasso di proliferazione notevolmente ridotto rispetto alla linea di controllo, e mentre le cellule di questa linea, pur essendo fortemente rallentate nel processo di formazione dei neuriti e di maturazione dei neuroni sembrano assumere una forma se non polarizzata, almeno stellata, le cellule shCSB mostrano una forma insolitamente allargata, particolarmente evidente nell’immagine a ingrandimento maggiore. Al 24° giorno, le cellule di controllo non sembrano avanzare significativamente nel processo di differenziamento neuronale, ma complessivamente, la popolazione sembra almeno rispondere a qualche segnale che probabilmente sta dirigendo e segnalando in merito all’organizzazione e la distribuzione spaziale delle cellule. Al contrario, le cellule CSB difettive sembrano più statiche, mantenendosi sostanzialmente fisse nella loro forma particolare, così fortemente allargata e nella loro organizzazione spaziale complessiva. Accanto alle osservazioni di tipo morfologico, siamo andati a misurare l’andamento dei livelli di produzione della proteina MAP2 con il Western Blotting, durante il differenziamento, sempre in condizioni di ipossia (Figura 32).

Fig. 32: Western Blotting relativo all’espressione della proteina MAP2 durante il differenziamento della linea ShK ed shCSB in condizioni di ipossia (1% di ossigeno). Nelle cellule di controllo le bande relative a MAP2 cominciano a comparire con una intensità non molto elevata (rispetto al segnale relativo alla banda dell’actina usata come proteina di riferimento) solo nelle fasi avanzate del differenziamento, mentre nelle cellule silenziate per CSB non si osservano le bande relative alla proteina MAP2 nonostante l’intenso segnale relativo all’actina.

Come si vede, nelle cellule della linea di controllo, le bande relative alla proteina MAP2 compaiono in una fase avanzata, verso il 15°-18° giorno del differenziamento, con una intensità molto più bassa rispetto alle bande relative all’actina usata come proteina di riferimento. Nelle cellule CSB difettive, invece, nessuna banda di intensità significativa rispetto all’actina, compare fino al 24° giorno considerato.

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