Ruolo di CSB nella risposta apoptotica

Considerando che il DNA di una cellula diploide umana ha una lunghezza di circa 2 metri e che la molecola è impacchettata in una struttura cromatinica complessa attraverso l’interazione con le proteine istoniche, ci si potrebbe chiedere come possa la cellula analizzare il proprio DNA alla ricerca di eventuali lesioni e determinare la severità del danno. La replicazione e la trascrizione sono due processi che spogliano il DNA del suo rivestimento istonico e scorrono il DNA separando i due filamenti accoppiati. Mentre la replicazione avviene soltanto nelle cellule in attiva proliferazione, e in particolare durante la fase S del ciclo cellulare, la trascrizione genica si realizza sia nelle cellule in proliferazione che non, e durante ogni fase del ciclo cellulare, eccetto che durante la mitosi, quando la cromatina si trova al massimo grado di condensazione e la trascrizione è soppressa. Per questo, il macchinario della trascrizione potrebbe essere utilizzato dalle cellule per monitorare l’integrità del DNA e per attivare la segnalazione relativa al danno. Inoltre, la trascrizione potrebbe essere considerata e agire come un dosimetro, per cui la severità del danno, la capacità di rimuovere le lesioni e la cinetica del recupero della sintesi dell’mRNA andranno a determinare se le cellule vivono o muoiono [52].

46 La trascrizione, negli eucarioti, viene realizzata da tre differenti RNA Polimerasi: la RNA polimerasi I trascrive il DNA ribosomiale in RNA ribosomiale usato per la produzione dei ribosomi; l’RNA Polimerasi II trascrive i geni in mRNA; e l’RNA Polimerasi III sintetizza l’RNA transfer e i piccoli RNA nucleari. Sebbene l’RNA Polimerasi I e III trascrivono il DNA a livelli elevati, l’estensione del DNA genomico trascritto è piuttosto ridotta in confronto con la lunghezza dell’mRNA dei geni trascritti dalla RNA Polimerasi II. Perciò ci si aspetta che l’RNA Polimerasi II passi in rassegna una porzione molto più grande del genoma rispetto alle altre due polimerasi, e possa per questo essere considerata un sensore migliore rispetto alle altre due RNA Polimerasi. Per di più, quando i complessi di RNA Polimerasi II sono bloccati sui siti di DNA lesionati, essi sono in grado di reclutare le proteine di riparazione del DNA, per avviare il processo TCR per la rimozione delle lesioni ostruenti, cosa che non sembra essere associata con le RNA Polimerasi I e III. Per queste ragioni l’RNA Polimerasi II risulta perfettamente adatta ad agire come sensore per le alterazioni a carico del DNA sul filamento stampo e allertare la cellula mediante l’attivazione delle vie che segnalano la presenza del danno [52].

Le lesioni al DNA che bloccano la fase di allungamento dell’RNA Polimerasi II possono avere severe conseguenze per le cellule, come l’induzione dell’apoptosi. Per contrastare l’apoptosi, le lesioni bloccanti la trascrizione vengono rimosse mediante TCR. Il blocco della trascrizione, innesca anche l’attivazione della risposta al danno al DNA che coinvolge il soppressore tumorale p53.

La sorveglianza e la riparazione del DNA sono fasi particolarmente importanti per le cellule in attiva proliferazione, prima che il DNA venga replicato nella fase S o che avvenga la segregazione dei cromosomi durante la mitosi. Un certo numero di proteine di segnalazione del danno, si sono evolute per mantenere le cellule bloccate in corrispondenza di specifici punti del ciclo cellulare per concedere alle cellule più tempo per riparare il proprio DNA prima di entrare nella fase S o nella mitosi. Esiste un fine equilibrio tra la riparazione delle lesioni che bloccano la trascrizione mediante il TCR per evitare l’apoptosi e la conseguente perdita di segnalazione del danno. Se il TCR è troppo efficiente, le cellule sopravvivono, ma potrebbero non avere il tempo sufficiente per riparare tutte le lesioni prima che queste vengano permanentemente fissate con la replicazione, una condizione, questa, che promuove la cancerogenesi. D’altra parte, una processo di TCR poco efficiente potrebbe portare a un’eccessiva morte per apoptosi, condizione che promuove il processo di invecchiamento [52].

Il danno al DNA può essere classificato come citotossico o mutagenico. Il danno citotossico al DNA, che include le lesioni ingombranti, i ponti interfilamento e le rotture a doppio filamento,

47 interferiscono con la trascrizione, la replicazione e la segregazione corretta dei cromosomi. Le lesioni mutageniche, invece, sono lesioni che non necessariamente interferiscono con i processi metabolici del DNA, ma che se non rimosse prima della replicazione possono causare errori di codifica della sequenza nucleotidica che portano a mutazioni e conseguentemente alla carcinogenesi. I meccanismi di segnalazione del danno al DNA sembrano essersi evoluti principalmente per rispondere alle lesioni di natura citotossica, mentre i meccanismi di riparazione si sono evoluti per fronteggiare entrambe le classi di lesioni al DNA.

Le lesioni stericamente ingombranti come i dimeri di pirimidina indotti dai raggi UV e gli addotti del cisplatino, che causano una consistente distorsione all’elica del DNA, possono agire sia come lesioni citotossiche che mutageniche a seconda della loro localizzazione nel genoma. Se sono situate sul filamento trascritto dei geni attivi, esse risultano citotossiche, poiché sono in grado di indurre l’apoptosi mediante il blocco della trascrizione. La citotossicità di queste lesioni viene soppressa mediante la loro rimozione attraverso il TCR, mentre lesioni simili altrove nel genoma vengono rimosse mediante l’altro sistema NER, la riparazione del genoma globale GGR. Pertanto, la funzione del TCR è primariamente quella di contrastare la segnalazione dovuta al danno al DNA e bloccare così l’apoptosi, mentre il GGR rimuove le lesioni pre-mutageniche e quindi reprime la carcinogenesi [52].

La proteina con funzione di soppressore tumorale, p53, ha un ruolo importante nel determinare il destino delle cellule in seguito all’esposizione al danno al DNA e a vari tipi di stress cellulari. In seguito a questi insulti, la proteina p53 si accumula all’interno del nucleo dove agisce come fattore di trascrizione nei confronti di specifici geni target. A seconda del tipo cellulare, e del livello di danneggiamento indotto, p53 può aumentare la sopravvivenza delle cellule colpite, mediante la trans-attivazione dei geni che codificano per enzimi di riparazione del DNA e inibitori del ciclo cellulare, o indurre le cellule al suicidio per apoptosi. In entrambi i casi, il risultato è quello di reprimere la mutagenesi e la successiva cancerogenesi. Diversi studi che hanno fatto uso di linee cellulari umane con specifici difetti nei processi di riparazione TCR e GGR, come fibroblasti primari provenienti da pazienti affetti da Xeroderma pigmentoso e sindrome di Cockayne, hanno dimostrato che il meccanismo che porta all’accumulo di p53 e all’apoptosi in seguito all’irradiazione con raggi UV, è dipendente dal danno al DNA [53]. Inoltre, l’attivazione di p53 e dell’apoptosi non dipende dalle rotture introdotte sul filamento di DNA dal processo stesso di riparazione del DNA, ma piuttosto, dipende dalle lesioni persistenti in modo specifico sul filamento trascritto dei geni attivi. Altri studi che hanno usato fibroblasti umani trattati con agenti che

48 inducono lesioni ingombranti al pari dei raggi UV, hanno mostrato che l’accumulo di p53 e l’apoptosi sono indotte a dosi molto più basse nelle cellule che sono difettive nel processo di rimozione delle lesioni ostruenti la trascrizione, rispetto alle cellule competenti. Queste osservazioni, secondo cui il danno persistente sul filamento trascritto attiva p53 e l’apoptosi, è stato confermato in esperimenti che hanno fatto uso di modelli murini con specifici difetti genetici nel GGR e nel TCR. Nei topi con un difetto a carico del processo TCR, ad esempio topi knockout per il gene csb (Csb-/-) e per il gene Xpa (Xpa-/-), lo sviluppo di una reazione cutanea come un’ eritema solare, dovuta all’apoptosi, si verifica a dosi di raggi UV-B molto più basse rispetto ai corrispettivi animali normali. In aggiunta, questa elevata ipersensibilità all’induzione di p53 dovuta ai raggi UV, è stata osservata nei topi Csb-/- e Xpa-/- , ma non nei topi knockout per il gene Xpc (Xpc-/-), che sono competenti per la riparazione mediante TCR, ma difettivi per il GGR. L’ipersensibilità alla luce ultravioletta correla strettamente con la ridotta capacità di queste cellule di recuperare la sintesi dell’ RNA in seguito all’irradiazione [54].

Molti complessi RNA polimerasi II in genere si arrestano brevemente dopo l’inizio della trascrizione. Perciò, ci si potrebbe chiedere come fanno le cellule ad evitare l’induzione di p53 e dell’apoptosi in queste situazioni. Pare che ci sia una differenza nella segnalazione che si attiva in risposta agli stress, indotta in seguito all’arresto dell’RNA Polimerasi II nelle fasi precoci del ciclo di trascrizione, rispetto all’inibizione della fase di allungamento della trascrizione.

L’inibizione della trascrizione durante la fase di allungamento, comporta l’accumulo all’interno del nucleo della proteina p53 modificata a livello della serina 15 e della lisina 382. Queste modificazioni post-traduzionali sono normalmente associate alla stabilizzazione della proteina. Al contrario, l’inibizione dell’RNA Polimerasi II nella fase di transizione fra l’inizio e l’allungamento della trascrizione attraverso l’inibizione della fosforilazione del dominio carbossilico della RNA Polimerasi II, determina l’accumulo della proteina p53 nel nucleo senza la concomitante fosforilazione a livello della serina 15 né acetilazione della lisina 382 di p53 [55]. Pertanto, sembra che solo dopo che l’RNA polimerasi II viene completamente fosforilata a livello del suo dominio carbossi-terminale e sia stata coinvolta nel processo di allungamento, il blocco va ad innescare l’induzione della via di risposta allo stress che risulta nelle modificazioni post-traduzionali della proteina p53. In questo modo le cellule evitano l’attivazione inappropriata di una risposta da stress, consentendo il normale stallo dei complessi di RNA Polimerasi II in prossimità del promotore.

49 Alcune linee di ricerca si sono poste come obbiettivo quello di studiare in che modo possa verificarsi l’accumulo della proteina p53 nel nucleo senza che questa venga fosforilata al livello della serina 15, e hanno posto l’attenzione sul principale regolatore dei livelli di p53, MDM2. La proteina MDM2 è un regolatore chiave della localizzazione e della stabilizzazione di p53, partecipando direttamente nel processo di esportazione di p53 dal nucleo. Si è visto che il livello cellulare di MDM2, diminuisce rapidamente in seguito al blocco della trascrizione. Di conseguenza, è possibile che l’accumulo di p53 in seguito al blocco della trascrizione sia legato alla diminuzione dei livelli di espressione di MDM2 [56].

Una questione ulteriore considerata è se la proteina p53 possa essere indotta dal blocco dei processi trascrizionali guidati dalle altre due polimerasi, le RNA Polimerasi I e III. Sono stati fatti diversi studi che indicano che il blocco della trascrizione mediata dall’ RNA Polimerasi II, è sufficiente a determinare l’induzione della proteina p53 e la successiva apoptosi nelle cellule umane. Per prima cosa, il TCR è un processo che riguarda i geni di competenza dell’RNA Polimerasi II, ma non i geni trascritti dalle RNA Polimerasi I o III, e le cellule difettive per il TCR sono ipersensibili all’induzione di p53 e dell’apoptosi in seguito all’irradiazione con raggi UV. Secondo, gli inibitori dell’RNA Polimerasi II, come l’α-amanitina, il DRB e l’H7, sono in grado di indurre p53 e l’apoptosi nelle cellule umane, e l’α-amanitina è specifica per l’RNA Polimerasi II. Infine, la microiniezione di anticorpi diretti contro l’RNA polimerasi II nel nucleo delle cellule umane, induce l’accumulo nucleare di p53, mentre questo non avviene con la microiniezione di altri anticorpi come ad esempio quelli contro l’actina o contro l’immunoglobulina G, dimostrando l’esistenza di una certa specificità del processo. Sebbene questi dati indichino che l’inibizione dell’RNA Polimerasi II è sufficiente per indurre p53 e l’apoptosi, è possibile che tale induzione in seguito al trattamento con agenti che danneggiano il DNA, venga guidata anche dal blocco dell’ attività delle RNA Polimerasi I e III. In uno studio in cui si osservava che l’accumulo di p53 poteva avvenire in seguito all’inibizione dell’RNA Polimerasi I, in realtà non veniva misurata direttamente l’inibizione della trascrizione guidata da questa polimerasi, ma si osservava che le normali strutture nucleolari in queste cellule venivano distrutte. E’ stato proposto che, in condizioni normali, p53 può venire scortata fuori del nucleo da MDM2 attraverso il nucleolo. Pertanto, la distruzione delle strutture nucleolari potrebbe inibire l’esportazione di p53, determinando l’accumulo della proteina nel nucleo. Poiché sia l’inibizione dell’RNA Polimerasi II che quella dell’RNA Polimerasi I porta alla rottura della struttura nucleolare, è probabile che l’accumulo di p53 nel nucleo in seguito al blocco

50 dei processi trascrizionali mediati dalle RNA Pol I e II, sia dovuto all’inibizione del processo di esporto di p53 attraverso il nucleolo [57].

Un altro meccanismo mediante il quale p53 si accumula nel nucleo in seguito all’inibizione della trascrizione, è che l’esportazione potrebbe essere legata al trasporto fuori del nucleo dell’RNA messaggero. E’ stato recentemente dimostrato che inibendo specificamente due componenti chiave del macchinario di esportazione dell’mRNA dal nucleo, come TAP e NUP160, la generale esportazione dal nucleo delle proteine contenenti il segnale di esportazione nucleare (NES), risultava anch’essa soppressa. Pertanto, l’esportazione fuori del nucleo, mediata dal segnale NES delle proteine, sembra essere legato all’esportazione dell’mRNA. Poiché, la proteina p53 contiene diverse sequenze NES, è probabile che il suo trasporto fuori dal nucleo sia assistito anche dall’esportazione dell’mRNA. Infatti, p53 può interagire con l’RNA e questa interazione può reprimere la funzione della proteina. La sequenza NES di p53 può essere attivata dall’ubiquitinazione mediata da MDM2 e diviene inattiva mediante la fosforilazione a livello della serina 15 di p53. E’ stato dimostrato che la microiniezione di un vettore di espressione dominante negativo NUP160 o di un anti-TAP per inibire specificamente l’esportazione dell’mRNA dal nucleo, comporta un significativo accumulo di p53 in questo compartimento cellulare. Pertanto, se la trascrizione viene inibita, meno RNA risulta disponibile per l’associazione con p53, portando ad una diminuzione del trasporto della proteina fuori dal nucleo [58] [59].

Quindi, il blocco della trascrizione dovuto al danneggiamento del DNA determina l’induzione dell’accumulo di p53 nel nucleo sia mediante le modificazioni post-traduzionali, sia mediante una riduzione nel processo di trasporto della proteina fuori dal nucleo, forse a causa della perdita di mRNA disponibile per l’esportazione. Questo collegamento tra il macchinario della trascrizione e la risposta di p53, assicura una rapida ricognizione e risposta del danno al DNA, che ha come obbiettivo finale la soppressione della tumorigenesi.

Il meccanismo mediante il quale le cellule vanno in apoptosi in seguito all’inibizione della trascrizione non è del tutto chiaro. Un meccanismo potrebbe coinvolgere la perdita di espressione di fattori di sopravvivenza ad una velocità superiore rispetto alla perdita di espressione di fattori pro-apoptotici. Ciò potrebbe portare ad uno spostamento dell’equilibrio tra sopravvivenza e morte, per cui ad un certo punto i fattori pro-apoptotici potrebbero capovolgere questo equilibrio in favore della morte. Un importante lavoro di McKay e collaboratori, ha suggerito l’idea che la trascrizione potrebbe agire come una sorta di dosimetro del danno al DNA [60]. Poiché le lesioni indotte al DNA dalla luce ultravioletta blocca in maniera efficace la trascrizione e sono introdotte

51 in maniera casuale nel genoma, la probabilità che un particolare gene venga inattivato da questo tipo di lesioni, dipende dalle dimensioni del gene stesso nel cromosoma. Se i geni pro-apoptotici sono più corti dei geni anti-apoptotici, la luce UV potrebbe inattivare di preferenza i geni anti- apoptotici più estesi e l’equilibrio potrebbe essere spostato in favore dell’apoptosi. E’ stato anche dimostrato che molti geni pro-apoptotici sono compattati e non così estesamente colpiti dalla radiazione ultravioletta come molti geni anti-apoptotici. In questo modo, il grado di danneggiamento, le dimensioni dei geni di regolazione dell’apoptosi e l’abilità delle cellule di recuperare la sintesi dell’RNA, sono tutti eventi che contribuiscono maniera passiva a sopprimere la carcinogenesi ed eliminare le cellule altamente danneggiate [60].

Risalgono ormai alla fine degli anni ’90, gli studi che per primi hanno dimostrato che le cellule derivate da pazienti Cockayne, sono più inclini ad andare in contro a morte per apoptosi in seguito al trattamento con radiazione ultravioletta, rispetto alle cellule umane normali, e che in queste cellule in seguito all’esposizione ai raggi UV si ha un accumulo della proteina p53 nel nucleo [61]. Poiché è stato proposto che il segnale per l’accumulo di p53 è rappresentato dal blocco della trascrizione da parte dell’RNA Polimerasi II sui filamenti di DNA trascrizionalmente attivi, così nelle cellule CS-B, l’aumento dei livelli apoptotici è legato al difetto di queste cellule nel processo TCR. Tuttavia, non era stato ancora considerato se questo aumento nei livelli di apoptosi fosse causato primariamente dalle mutazioni a carico del gene csb piuttosto che da altri difetti secondari che caratterizzano le cellule CS. In un lavoro del 2000, Balajee prende in considerazione la questione conducendo esperimenti sia su cellule di topo (linea UV61), che su cellule di Cockayne umane, CS- B, allo scopo di studiare il ruolo della proteina CSB nella risposta apoptotica indotta dai raggi UV [62]. In particolare, Balajee ha valutato anche gli specifici domini funzionali della proteina CSB, eventualmente coinvolti nell’apoptosi indotta da raggi UV. Per determinare se l’attività ATPasica di CSB fosse importante per modulare questa risposta apoptotica, è stata creata una linea di cellule UV61 stabilmente trasfettata con un cDNA di CSB, contenente una mutazione puntiforme nel residuo di acido glutammico altamente conservato nel motivo ATPasico II. Accanto al dominio ATPasico CSB contiene anche una regione carica negativamente all’estremità ammino-terminale prima del motivo elicasico/ATPasico; circa il 60% dei residui di questo tratto di 39 amminoacidi è di natura acidica. I domini acidici sono stati trovati in un certo numero di proteine associate alla cromatina e agli istoni, suggerendo che questo dominio potrebbe essere coinvolto nel rimodellamento della cromatina o nell’attivazione della trascrizione. Per determinare l’importanza funzionale di questo dominio, è stata generata una linea cellulare in cui dieci residui acidici

52 consecutivi venivano deleti dalla proteina CSB. Si osservò che le cellule CSB difettive sia di topo che umane sono più predisposte all’apoptosi rispetto alle cellule normali dopo l’irradiazione con UV. La trasfezione delle cellule UV61 con il gene csb normale, ma non il mutante con l’alterazione puntiforme a livello del motivo ATPasico, è in grado di proteggere le cellule dall’apoptosi. Ciò dimostra che è necessario un prodotto CSB funzionale, con attività ATPasica intatta per modulare la risposta apoptotica ai raggi UV. Le cellule che contengono un’ampia delezione a livello del dominio acidico di CSB non mostrano nessun incremento della morte cellulare, indicando che questo dominio non è coinvolto nella regolazione dell’apoptosi. Sia le cellule umane, normali o CSB difettive che le cellule di topo sono state irradiate con raggi UV e osservate al microscopio a fluorescenza per l’identificazione delle cellule apoptotiche, necrotiche e vitali in base all’incorporazione dei coloranti fluorescenti quali Ioduro di Propidio (IP) e Fluoresceina diacetata (FDA). Per le linee umane, marcate e osservate 48 ore dopo l’irradiazione con diverse dosi di raggi UV, si ottenne una percentuale di cellule apoptotiche di circa il 40% nelle cellule CSB difettive, rispetto a quelle normali. Le linee cellulari di topo utilizzate erano tre: le linea AA8, costituita dalle cellule normali, di controllo, da cui furono derivate le cellule UV61, difettive per CSB e le cellule PT5, che costituivano la linea trasfettata con il gene csb umano. Queste tre linee vennero irradiate con una dose di 6J/m2 di raggi UV, e marcate dopo 24 ore. I risultati mostravano una percentuale di cellule apoptotiche dell’1%, sia nelle cellule AA8 di controllo, che in quelle irradiate. Nelle cellule UV61 invece, la percentuale di apoptosi era di circa il 48%. La morte per apoptosi diminuiva sensibilmente nelle cellule PT5, dove solo il 5% risultava essere apoptotica. Questo dato suggeriva chiaramente che il gene csb normale può ristabilire la resistenza cellulare ai raggi UV. Nelle cellule UV61 mutanti con il dominio ATPasico di CSB completamente inattivato, la morte per apoptosi si