Interattori noti di CSB

Molti studi si sono concentrati sullo studio delle proteine che interagiscono con CSB, a volte con risultati contraddittori [2].

La prima più importante proteina da considerare è la proteina CSA, espressa dal gene ERCC8/CSA che è il gene mutato nei pazienti con sindrome di Cockayne appartenenti al gruppo di complementazione A. Il gene è situato sul cromosoma 5q12-q31 e codifica per una proteina di 46 kDa con cinque motivi WD40 ripetuti. Le proteine che costituiscono questa famiglia sono funzionalmente diverse, con ruoli nella trasduzione del segnale, nel processamento dell’RNA, nella trascrizione generale e nella divisione cellulare, ma condividono una struttura simile. L’unica struttura cristallografica risolta è quella della subunità Gβ delle proteine G eterotrimeriche. Le cellule difettive per CSA condividono molte caratteristiche cellulari con le cellule CSB difettive e presentano un’inibizione del recupero della sintesi di RNA e del TCR dopo somministrazione di raggi UV. CSA interagisce con XAB2, in vitro ed in vivo e con la subunità p44 del fattore TFIIH in vitro. Di recente è stata mostrata anche un’interazione con il dominio N-terminale della topo isomerasi I. CSA è stata trovata in un complesso con DDB1, Cul4A, Roc1 e CSN. Questo complesso possiede attività di ubiquitina ligasi, regolata in maniera UV-dipendente. Non sono state trovate interazioni con p62, XPD, XPB o XPG.

43 In merito all’interazione tra le proteine CSA e CSB esistono risultati contrastanti. In alcuni studi, è stata trovata un’interazione mediante tecniche di co-immunoprecipitazione (co-IP) delle proteine tradotte, in vitro, che sembrerebbero supportati da uno studio su doppi ibridi nel lievito [48]. Tuttavia, nessuna interazione è stata trovata usando la tecnica co-IP su estratti cellulari totali, filtrazione su gel e co-purificazioni. CSA e CSB non sembrano colocalizzare all’interno del nucleo quando viene usata l’immunofluorescenza, e CSB può essere isolata in un grosso complesso in cui non si ritrova CSA. Pur implicando la mancanza di una forte interazione diretta, questi risultati non escludono la possibilità di un’interazione debole e transitoria tra le due proteine, probabilmente indotta dal danneggiamento al DNA. CSA viene traslocata nella matrice nucleare in seguito al danno, in maniera CSB-dipendente, dove essa interagisce con l’RNA Pol Iio [49]. Oltretutto, il complesso che contiene CSA interagisce con l’RNA Pol Iio dopo l’irradiazione con luce UV.

Il gene XPB, localizzato sul cromosoma 2q21, codifica per un polipeptide di 89 kDa. Mutazioni a carico di questi geni provocano la malattia di tipo XPB/CS, o la tricotiodistrofia TTD. La proteina XPB è una elicasi 3’-5’ ed è una delle nove subunità di TFIIH. XPB funziona come parte del fattore TFIIH nell’inizio della trascrizione dell’RNA Pol I e II e nella fase di svolgimento del DNA nel NER. Attraverso l’uso di un tag di proteina fluorescente verde (GFP-tag), si è visto che la proteina XPB è omogeneamente distribuita nel nucleoplasma, con un particolare arricchimento a livello dei nucleoli. La localizzazione nucleolare risulta abrogata dall’irradiazione con raggi UV. XPB interagisce con la subunità XPD di TFIIH, con p62, p44, p34 e con XPG. Si è visto che XPB e CSB interagiscono; un’interazione è indicata anche dalla capacità di un fattore contenente XPB di spostare un complesso di allungamento RNA Pol II:DNA:RNA:CSB solo quando in esso è contenuta la proteina CSB. Alcuni ricercatori hanno trovato che usando la cromatografia le proteine XPB e CSB sono frazionate in maniera differenziale. Al contrario, altri studi recenti riportano la colocalizzazione di XPB con CSB e l’RNA Pol I in preparazioni di matrice nucleare e identificano XPB in complessi contenenti CSB immunoprecipitati a concentrazioni saline fisiologiche [50].

XPD è un’elicasi simile a XPB, ma con direzionalità opposta, 5’-3’. E’ anche una subunità di TFIIH e partecipa agli stessi processi menzionati per XPB. Il gene è localizzato sul cromosoma 19q13.2- q13.3 e quando è mutato da origine a uno dei tre disordini: XP, TTD o XPD/CS. Come XPB, essa interagisce con alcune altre subunità di TFIIH, chiamate p62, p44 e p34 e può coprecipitare con XPG in vitro. XPD non viene purificato insieme con CSB. Tuttavia, XPD può essere trovato nello stesso grosso complesso contenente CSB con cui si è visto interagire anche XPB. Questo complesso sembra essere in grado di sostituire il fattore TFIIH nella trascrizione e nel saggio di incisione in

44 vitro. E’ stato proposto che mutazioni a carico di XPB e XPD, che possono portare entrambe a un parziale fenotipo CS, potrebbero destabilizzare questo complesso e perciò compromettere la funzione di CSB [50].

XPG è il terzo gene le cui mutazioni possono dare origine a un fenotipo intermedio XP/CS. E’ localizzato sul cromosoma 13q33 e codifica per una DNA endonucleasi responsabile dell’incisione al 3’ della lesione al DNA nel processo di riparazione mediante il NER. In tutti i casi riportati, le mutazioni nel gene XPG, producono una proteina tronca severamente compromessa nelle sue funzionalità, mentre in un caso è stata trovata un proteina integra con una mutazione che abolisce la sua attività endonucleasica. E’ stato suggerito che la proteina XPG può stimolare l’attività di incisione della DNA glicosilasi Nth1, che è coinvolta nella riparazione mediante BER del danno ossidativo in vitro. Sono state dimostrate le interazioni tra XPG e XPB, XPD, p62 e p44. Usando la tecnica di co-IP in vitro, è stata mostrata l’interazione tra XPG e CSB, ma esse non co-purificano né co-precipitano dagli estratti cellulari totali derivati dalle HeLa [51]; tuttavia, XPG prende parte al grande complesso contenente CSB. Le mutazioni che producono il troncamento severo della proteina possono potenzialmente destabilizzare questo complesso, come osservato nel caso di XPB e XPD.

Il gene XPA è coinvolto nelle fasi precoci del NER, ma il suo ruolo preciso non è ben chiaro. Si ritiene che contribuisca al riconoscimento del danno al DNA e che sia necessario sia per il GG-NER che per il TC-NER. La proteina XPA interagisce con altre proteine del NER, tra cui TFIIH, XPF/ERCC1 e RPA. XPA è stato trovato in interazione con una proteina prima sconosciuta, XAB2. Un’interazione tra CSB e XPA potrebbe teoricamente fornire il collegamento tra il TCR e un fattore precoce classico del NER. Tuttavia, ciò è stato provato mediante due metodi differenti, con risultati contrastanti.

Come suggerito dal suo ruolo nella trascrizione e nella riparazione, CSB interagisce con la RNA Pol II, in vitro e risiedere in un grosso complesso in comune con essa. La proteina CSB interagisce con la Polimerasi Iia e Iio, con una preferenza per la Polimerasi Iio. La proteina CSB è coinvolta anche nella trascrizione da parte dell’RNA Pol I ed è stata trovata in un complesso contenente la proteina RPA 116 (dell’RNA Polimerasi I) e TAF68, ma senza RPB1 (dell’RNA Pol II) né TAFII250. Queste

discrepanze si spiegano considerando il fatto che CSB si trova nel complesso con RNA Pol I quando viene purificata usando il KCl 150mM, mentre si trova nel complesso con l’RNA Pol II quando viene usato il KCl 50 mM. E’ possibile che le variazioni dipendenti dalla concentrazione salina dell’

45 associazione di CSB con questi complessi, rifletta le differenze nella concentrazione osmotica tra il nucleolo e le regioni trascritte dall’RNA Pol II [50].

I complessi contenenti CSB isolati a concentrazioni saline fisiologiche, contengono anche le subunità p44 e p62 di TFIIH. Tutte e due interagiscono con XPB, XPD, XPG, mentre soltanto p44 interagisce direttamente con CSA.

E’ stato riportato che CSB interagisce con la subunità p34 del fattore TFIIE, con il soppressore tumorale p53 e con la coda N-terminale delle proteine istoniche. Di recente, p53 è stata proposta come fattore di accessibilità alla cromatina durante il processo di riparazione GG-NER. Il rilassamento della cromatina viene iniziato probabilmente dal blocco di un complesso RNA Polimerasi attivo nella trascrizione, ma è indipendente dal processo di riparazione TCR e dalle funzioni di CSB.

Diverse proteine sono state saggiate per la loro capacità di interagire con la proteina CSB con esito negativo, tra cui la subunità p56 di TFIIE, TFIIF, RPA e XPC/ERCC1. Riassumendo, CSB interagisce fisicamente con CSA, con l’RNA Pol II, XAB2, gli istoni, TFIIE e p53 e può trovarsi in complessi con XPA, XPB, XPD, XPG, RNA Pol I e le subunità p44 e p62 di TFIIH [2].