Induzione di CSB durante il differenziamento

Abbiamo poi voluto monitorare l’andamento nei livelli di espressione del gene csb durante il differenziamento. Nonostante il nostro sistema cellulare sia costituito da cellule trasfettate con particelle lentivirali per ottenere il silenziamento del gene csb mediante RNAi in cui l’mRNA trascritto dal gene csb viene continuamente degradato, fino ad ottenere una riduzione dell’espressione del gene di circa il 65% nella linea 2 rispetto a quella di controllo, con una certa sorpresa abbiamo potuto osservare, mediante RT-PCR, che nelle cellule ShK si ha l’induzione del gene durante il differenziamento. Come si vede nel grafico a istogrammidi Figura 25, nelle cellule ShK l’espressione dell’mRNA di CSB aumenta progressivamente coi giorni e presenta un picco massimo tra il 12° e il 18° giorno, mentre nelle cellule silenziate questo aumento è molto meno consistente, ovviamente a causa della continua interferenza dell’ shRNA che degrada il trascritto primario di CSB in questa linea.

Fig. 25: Istogramma relativo ai livelli di espressione dell’RNA messaggero di CSB durante il differenziamento. Nelle cellule shK l’espressione di CSB aumenta progressivamente nei giorni fino a raggiungere un livello massimo di espressione tra il 12° e 18° giorno; nelle cellule shCSB, l’ aumento non è significativo a causa dell’ RNA interfering che degrada continuamente l’RNA messaggero di CSB

108 L’incremento nei livelli dell’ mRNA di CSB, risulta notevole nelle cellule ShK, arrivando ad un livello di espressione che è più di sette volte maggiore rispetto a quello di partenza. Evidentemente l’espressione di CSB e la sua sovra-regolazione sono necessari in qualche modo ai fini del differenziamento neuronale, come dimostrano le varie anomalie già osservate nella linea difettiva per CSB durante il differenziamento.

Anche in questo caso abbiamo utilizzato la microscopia confocale per analizzare visivamente e semiquantitativamente l’espressione della proteina CSB nelle due linee cellulari. Abbiamo usato l’Ab 1° 1A11 diretto contro CSB, la cui espressione è evidenziata con il segnale fluorescente verde (Figura 26). Abbiamo scelto di mostrare il giorno 9 del differenziamento perché è quello in cui il protocollo prevede l’arricchimento di cellule neuronali nella popolazione dei progenitori e perché in questo giorno possiamo osservare le stesse differenze morfologiche nel grado di polarizzazione tra cellule shK ed shCSB e apprezzare le differenze nel grado di intensità del segnale; si vede bene come tale segnale relativo all’espressione di CSB sia più forte nelle cellule K e più debole nelle cellule CSB riflettendo la maggiore espressione della proteina nelle cellule di controllo rispetto a quelle silenziate, in accordo con i dati della Real time sul silenziamento di CSB.

Fig. 26: Immunofluorescenza relativa all’Ab 1° 1A11 diretto contro CSB in corrispondenza del giorno 9 del differenziamento. Nella foto di sinistra il segnale verde relativo all’espressione CSB è molto più intenso nelle cellule di controllo rispetto a quelle silenziate. In blu nell’immagine centrale sono evidenziati i nuclei marcati col DAPI e nella foto a destra le due fluorescenze sono combinate insieme.

109 Nella Figura 27, immagini simili sono state prese a contrasto interferenziale con obbiettivo a ingrandimento 63X, che insieme alla fluorescenza verde relativa a CSB consente di ricavare informazioni aggiuntive relative alla distribuzione della proteina nei vari compartimenti cellulari.

Fig. 27: Particolare ingrandito di cellule fotografate al microscopio confocale con obiettivo 63X. Nell’ immagine di sinistra si evidenzia la fluorescenza verde relativa all’Ab 1A11 diretto contro CSB in cui si vede che la proteina è maggiormente espressa nelle cellule di controllo rispetto a quelle silenziate e sembra di poter dire che oltre ad essere presente nel nucleo CSB è distribuita anche nel citoplasma circostante, in zone perinucleari e nei prolungamenti citoplasmatici. Nella foto di destra l’immagine è presa in luce trasmessa per evidenziare la morfologia cellulare e confrontare con questa la distribuzione della fluorescenza verde.

Osservando le immagini si vede che il segnale fluorescente verde relativo all’ Ab 1A11 diretto contro CSB è più intenso nella linea di controllo rispetto alla linea silenziata, ma la cosa interessante è la distribuzione della proteina: CSB oltre ad essere localizzata all’interno del nucleo, dove sappiamo essa svolge la sua funzione di rimodellatore della cromatina nella riparazione dei danni al DNA e nel modulare la trascrizione, si trova anche in una zona perinucleare circostante il nucleo,in quella porzione del citoplasma del corpo cellulare dei neuroni detta pericarion e lungo i prolungamenti neuritici. Ciò suggerirebbe la presenza di CSB a livello citoplasmatico o l’esistenza di un’ isoforma citoplasmatica della proteina, ipotesi questa ancora al vaglio della sperimantazione. In questo ingrandimento si vede molto bene la differenza tra le morfologie cellulari, dove mentre le cellule di controllo presentano questi spessi prolungamenti neuritici-assonali che partono dal

110 corpo cellulare, le cellule CSB difettive non riescono a finalizzare l’organizzazione del citoscheletro per la formazione di una struttura che prepara la formazione di un assone, se non in misura minore. Nella Figura 28, sono mostrate le immagini relative alla doppia marcatura delle cellule shK con gli anticorpi, 1A11 per l’espressione di CSB in fluorescenza verde, e Tuj1 per la β-tubulina III in fluorescenza rossa. Nell’immagine più grande della figura, viene mostrata la combinazione dei due segnali fluorescenti, omettendo il segnale azzurro relativo al DAPI con cui sono marcati i nuclei; si vede che il segnale relativo all’espressione di CSB e quello relativo alla β-tubulina III sembrano colocalizzare nelle stesse regioni del citoplasma di questi neuroni al 12° giorno del differenziamento. La fluorescenza verde relativa a CSB si distribuisce oltre che nel nucleo, anche nei neuriti delle cellule e si sovrappone estesamente al segnale fluorescente rosso che è esclusivamente citoplasmatico. Questa colocalizzazione dei segnali fluorescenti relativi a CSB e alla tubulina suggerirebbe quindi, che CSB avrebbe oltre a quella nucleare anche una distribuzione citoplasmatica.

Fig. 28: Immagini al microscopio confocale relative alla doppia marcatura delle cellule ShK con gli anticorpi 1A11, diretto contro CSB (segnale verde) e Tuj1 contro la β-tubulina III (segnale rosso) intorno al 12° giorno del differenziamento. I due segnali fluorescenti sembrano colocalizzare estesamente nel citoplasma fuori del nucleo e lungo i prolungamenti neuritici suggerendo che la proteina CSB possa avere oltre a quella nucleare una distribuzione citoplasmatica.

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