Interattori di CSB ed esperimenti di ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation)

Il dato ottenuto con la RT-PCR, relativo all’incremento dei livelli di trascrizione del gene csb nelle cellule di controllo, inizialmente non era atteso. Subito dopo però abbiamo considerato alcuni dati ottenuti precedentemente. Per prima cosa un dato ottenuto da esperimenti di RT-PCR relativo al confronto dell’espressione del gene csb tra fibroblasti primari e progenitori neurali adulti entrambe umani, dove si era visto che già in condizioni basali di crescita in vitro, il livello di espressione del gene csb è più alto di circa il 70% nelle staminali neuronali rispetto ai fibroblasti. In secondo luogo, abbiamo riesaminato una serie di dati, ancora non pubblicati, ottenuti da esperimenti di immunoprecipitazione per doppia affinità (TAP-TAG) condotti tempo fa da altri ricercatori del nostro gruppo, che hanno consentito di identificare numerose proteine che sembrano interagire con la proteina CSB. La maggior parte delle proteine identificate si possono ascrivere a due gruppi principali: uno, quello di componenti del citoscheletro come DINEINA1, DINACTINA1, FILAMINA A, CLATRINA, e poi LAMINA A/C e MATRINA3. Queste interazioni potrebbero indicare un ruolo pleiotropico del gene csb e il possibile coinvolgimento della proteina in quello che, richiamando la sua funzione nota, si potrebbe indicare come una sorta di “rimodellamento del citoscheletro”, riferendoci con ciò alla profonda riorganizzazione che subiscono le cellule neuronali nel loro processo di maturazione; infatti, nel differenziamento neuronale la riorganizzazione del citoscheletro cellulare è un processo che ha un significato cruciale perché non è limitato solo alla forma cellulare, ma in questo tipo cellulare ha uncarattere fortemente funzionale. Infatti, l’allungamento dei neuriti che diverranno assoni, e l’organizzazione del citoscheletro per dare un cellula polarizzata in una porzione dendritica e una assonale ha a che fare con la trasmissione del segnale, con l’instaurarsi della comunicazione sinaptica e con l’attività elettrica di queste cellule. L’altro gruppo di proteine identificate è quello di subunità appartenenti ad importanti complessi di rimodellamento della cromatina specifici del differenziamento neuronale come BAF170, BAF53A, BRG1 (o SMARCA4) e BAF47 (o SMARCA1). Questi grossi complessi multiproteici cambiano il loro assetto in subunità, a mano a mano che il differenziamento procede passando dalla fase di cellula staminale embrionale totipotente, al progenitore neural committed, cioè avviato al differenziamento in senso neuronale non più totipotente ma pluri- o multi-potente, fino al neurone post-mitotico terminalmente differenziato; il fatto che alcune subunità di questi complessi coprecipitano con CSB, suggerisce che anche CSB

112 possa prender parte in qualche modo in questi complessi di rimodellamento della cromatina neuro-specifici. I nostri risultati relativi all’andamento dei livelli di espressione del gene MAP2 durante il differenziamento, in cui abbiamo trovato una progressiva sovraregolazione del gene nelle cellule della linea shK, insieme al dato relativo all’induzione nell’espressione del gene csb, ci ha suggerito la possibilità che il gene MAP2 possa essere uno dei geni target di questi complessi di rimodellamento della cromatina, in cui CSB potrebbe essere coinvolta con la sua attività di fattore rimodellatore.

In base a questa ipotesi abbiamo progettato alcuni esperimenti di ChIP, al momento sulla sola linea di controllo, per fotografare lo stato del promotore del gene MAP2 relativamente al legame dell’RNA Polimerasi II e di altri fattori che possono essere coinvolti nell’ inizio della trascrizione. Riuscire a determinare la presenza o meno di questi fattori a livello del promotore genico e quindi stabilire chi si trova legato e quando in prossimità del sito di inizio della trascrizione, può fornire informazioni circa lo stato trascrizionale del gene, ossia indicare se esso si trova in uno stato silente e trascrizionalmente inattivo, oppure se è attivamente espresso. Inoltre, osservare il legame di un fattore di interesse sul promotore di un gene specifico, può fornire una prima indicazione del fatto che molto verosimilmente, quel fattore prende parte nella modulazione dell’espressione di quel gene.

In un tipico saggio di ChIP, il DNA e le proteine vengono cross-linkate affinché siano mantenute le associazioni tra le proteine e le loro sequenze bersaglio sul DNA. La cromatina viene poi frammentata e usata per l’immunoprecipitazione dei complessi DNA-proteine mediante l’uso di anticorpi specifici diretti contro le proteine di interesse. Il DNA immunoprecipitato viene purificato, e le sequenze associate con le proteine precipitate sono identificate mediante PCR, sequenziamento o ibridazione su microarrays.

Nella Figura 29 sono riportati gli istogrammi che riassumono i risultati degli esperimenti di ChIP per la regione ‒1000/0 (regione a monte del sito di inizio della trascrizione) del gene MAP2, sulle cellule di controllo, in due momenti chiave del differenziamento, cioè nello stato indifferenziato (‒ diff) e al 12° giorno circa del differenziamento (+ diff).

I fattori proteici di cui abbiamo voluto studiare la cinetica di legame al promotore di MAP2 in questi esperimenti sono stati principalmente quattro: la subunità maggiore del complesso della RNA Polimerasi II (Rpb1), come complesso enzimatico primariamente coinvolto nella trascrizione e produzione dell’ RNA messaggero del gene, la cui presenza a livello del promotore indica se e in che misura esso viene espresso nella cellula; CSB, in quanto proteina di nostro interesse, per

113 verificare l’ipotesi e il grado del suo eventuale coinvolgimento nella modulazione della trascrizione del gene MAP2; BRG1, come uno dei putativi interattori della proteina CSB da noi identificati per valutare la sua eventuale cooperazione con CSB nella regolazione di MAP2; l’enzima ad attività deacetilasica HDAC3, che prendendo parte ai cicli di acetilazione/deacetilazione dagli istoni del DNA, è coinvolto nel regolare l’accessibilità dei fattori di trascrizione sui promotori genici.

Come si vede dai due grafici in alto della Figura 29, sia per l’RNA Pol II che per la proteina CSB il legame al promotore sembra aumentare al 12° giorno del differenziamento rispetto all’inizio, cioè nella fase precedente all’avvio del differenziamento (‒diff), ad indicare un progressivo arricchimento della Polimerasi II e di CSB sul promotore di MAP2. Per quanto riguarda invece BRG1, non sembra di poter osservare un cambiamento molto significativo riguardo al suo legame al promotore prima e durante il differenziamento, mentre si osserva una depletion, cioè una diminuzione del legame dell’enzima HDAC3 sul promotore di MAP2 al 12° giorno del differenziamento rispetto allo stato indifferenziato iniziale (grafici in basso). Questi primi dati forniscono importanti suggerimenti circa la regolazione dell’espressione genica di MAP2 durante il differenziamento dei progenitori neuronali, in cui la proteina CSB sembra di fatto avere un qualche ruolo. Il fatto che la cinetica di occupazione del promotore MAP2 da parte della proteina CSB, aumenti significativamente in corrispondenza del 12° giorno del differenziamento, indicherebbe che essa è un fattore necessario per l’up-regolazione della trascrizione di MAP2 osservata durante il differenziamento, e che le cellule silenziate, essendo deficitarie della funzione di CSB, non riescono a sostenere in maniera efficace l’incremento dei livelli della proteina MAP2, richiesto nel processo di neuritogenesi. Gli esperimenti di ChIP sulla linea shCSB di questi progenitori neurali sono ancora in corso.

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Fig. 29: La cromatina solubile è stata preparata dalle cellule della linea di controllo e sottoposta al saggio ChIP utilizzando anticorpi contro la subunità maggiore dell’RNA pol II, CSB, BRG1 e l’enzima HDAC3. LA Real-time PCR è stata eseguita utilizzando primer specifici per testare il relativo delle proteine di interesse nella regione del promotore ‒1000/0 situata immediatamente a monte del sito di inizio della trascrizione

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