E-SCREEN ASSAY O SAGGIO DI PROLIFERAZIONE CELLULARE

L’E-screen è un saggio biologico riconosciuto universalmente valido ed ampliamente utilizzato in diversi studi di letteratura (Korner et al., 1999; Bicchi et al., 2008), poiché permette di rilevare in tempi brevi e a costi ristretti la presenza di molecole estrogeniche in

campioni sperimentali. Il test confronta la proliferazione delle cellule MCF-7dopo cinque

giorni di coltura in un mezzo deprivato di estrogeni, in presenza o assenza di diverse concentrazioni di E2 o dei campioni incogniti da testare (Soto et al., 1995). La proliferazione può essere valutata semplicemente mediante conta cellulare o, come nel presente lavoro, attraverso la determinazione della vitalità cellulare, mediante il test del MTT. Il saggio è estremamente sensibile anche a basse concentrazioni di E2 o di sostanze simil-estrogeniche ed è in grado evidenziare l’attività estrogenica sia di un singolo composto che di miscele, richiedendo piccole quantità, e fornendo dei dati, il più delle volte, attendibili, accurati e ripetibili. Sebbene la semplicità di questo saggio biologico renda di relativa facilità la sua applicabilità, ci sono molti fattori, tuttavia, che possono interferire con il risultato. Fra questi, la differenza dei vari cloni di linee cellulari, le condizioni di coltura, le diverse modalità di valutazione della crescita cellulare, il lotto dei sieri utilizzati per le colture. Nello stesso siero fetale bovino utilizzato per la coltivazione delle cellule, sono stati identificati composti mitogeni capaci di incrementare la proliferazione cellulare e tutti questi elementi complicano la standardizzazione del test. L’applicabilità dell’E-screen a matrici complesse (ad esempio alimenti, campioni di tessuto) e/o a miscele presenti nell’ambiente e negli alimenti deve essere, comunque, ulteriormente elaborata per garantirne la ripetibilità.

L’attività sperimentale ha avuto come obiettivo iniziale quello di valutare la sensibilità e la specificità del saggio biologico, nel rilevare gli analiti scelti per la sperimentazione, anche in funzione del solvente (metanolo) adoperato per le soluzioni, mentre, in seconda battuta, l’applicabilità del test all’analisi dei campioni sperimentali di estratti di matrici acquose. Nello specifico, nel momento in cui le cellule vengono seminate nelle piastre è necessario stabilire, in base agli obiettivi della ricerca e al materiale biologico a disposizione, il numero di esperimenti da realizzare e le opportune condizioni sperimentali con cui si vogliono eseguire.

Un accurato disegno sperimentale risulta fondamentale in fase di messa a punto del metodo, per avere un’idea di quelli che potranno essere gli esiti sperimentali ed, inoltre, facilita, in fase di esperimento, le procedure e l’iter logico da seguire per completare i trattamenti.

diluizioni seriali, scelte ad hoc, in base ai livelli di concentrazione di interesse. Come precedentemente accennato, le indagini preliminari sono servite per valutare il livello di sensibilità del nostro test, che ha portato alla costruzione di una curva standard di 17-β estradiolo in un intervallo di sette concentrazioni diverse (da 10-15 a 10-8 M) (Rapporti ISTISAN 11/18). L’estradiolo è la molecola di riferimento per quantificare le potenzialità estrogeniche/ antiestrogeniche dei diversi contaminanti ambientali. La valutazione di un campione, infatti, viene espressa in termini di Effetto proliferativo (Proliferative Effect, PE), ovvero il rapporto tra l’effetto massimo indotto dalla sostanza test e il controllo in assenza di E2.

PE= (Effetto massimo della sostanza test) / (Controllo in assenza di E2)

Ulteriori parametri che caratterizzano l’estrogenicità di una molecola sono il Relative Proliferative Effect

RPE=100x [(PE -1) sostanza test] / [(PE-1) estradiolo]

ed il Relative Proliferative Potency, inteso come il rapporto tra le dosi di E2 e di sostanza test in grado di produrre il PE max x100.

Nell’E-screen assay è impiegato, come controllo positivo di attività anti-estrogenica, il tamoxifene (TAM), il principio attivo di un noto farmaco antitumorale, che agisce legandosi al recettore ER, inibendo, quindi, il legame degli estrogeni e la conseguente proliferazione cellulare.

3.2.1 Condizioni di esposizione delle cellule

L’esposizione al Bisfenolo A, uno degli interferenti endocrini ad attività estrogenica maggiormente studiato e scelto come controllo positivo in diversi studi sperimentali, o ai campioni ambientali di acqua oggetto di indagine, è stata effettuata come di seguito descritto. Dalle cellule in coltura è stato rimosso il mezzo di crescita e sostituito con l’opportuno trattamento. Gli estratti dei campioni di acqua sono stati utilizzati a due diverse

concentrazioni, 20x e 200x, come indicato nei risultati. Gli effetti dell’estradiolo sulla

crescita cellulare sono stati valutati ad una concentrazione di E2 10-9 M, mentre gli effetti

inibitori del TAM sono stati indagati ad una concentrazione di 10-7 M. Le cellule in presenza

di E2/campione da saggiare sono trasferite in incubatore per 5 giorni, tempo di esposizione necessario per rilevare gli effetti estrogenici.

3.2.2 Test di vitalità (MTT)

Il test di vitalità MTT è un test quantitativo colorimetrico che permette di stimare il numero di cellule aventi ancora attività mitocondriale, che quindi sono vitali. Si basa sull’impiego di un indicatore metabolico, l’MTT (3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)2-5-difeniltetrazolio bromuro), un sale solubile di tetrazolio che, nelle cellule vitali, è ridotto nel mitocondrio ad opera dell’enzima succinato deidrogenasi, a formare un cristallo insolubile (formazano) in acqua, di color viola; la quantità di formazano prodotta è proporzionale al numero di cellule vive presenti in coltura e viene quindi utilizzata come misura della vitalità cellulare.

I cristalli, solubilizzati in una soluzione di isopropanolo acidificato, sono quantificati con modo colorimetrico alla lunghezza d’onda di 570 nm (assorbanza del colorante ridotto) con correzione di background a 650 nm. La reazione può avvenire solo nelle cellule metabolicamente attive e il valore dell’assorbanza, ottenuta mediante lettura spettrofotometrica, può essere correlata al quantitativo di cellule vitali presenti, risultando quindi maggiormente informativa, attendibile e riproducibile rispetto alla semplice conta cellulare. Il protocollo prevede che i pozzetti in cui sono stati fatti crescere le cellule siano svuotati, in sterilità, dal mezzo di coltura e addizionati con 1 mL di una soluzione di MTT 0,5 mg/ml ottenuta diluendo 10 volte la soluzione madre di MTT, in DMEM senza rosso fenolo. Le piastre sono trasferite in incubatore a 37°C per 1,5 ore. Trascorso tale periodo, si rimuove la soluzione di lavoro e si aggiunge 1 mL per pozzetto di isopropanolo acidificato (HCl al 37% (Sigma) 332 µL e Isopropanolo (Sigma) 100 mL), allo scopo di rompere le membrane cellulari e solubilizzare il formazano (Figura 3.3). Le letture vengono effettuate a 570 nm contro bianco di HCl/isopropanolo utilizzando uno spettrofotometro multicuvetta

(

effettuate in cellule coltivate in piastre da 96 pozzetti, anche se in queste condizioni l’effetto proliferativo (PE) massimo indotto da E2 è risultato molto variabile rispetto a quello osservato nelle piastre da 24 pozzetti, scelte quindi come supporto per questo saggio.