EFFETTI DI DUE EM RAVVICINATE IN RATTI SHR

Sono stati valutati gli effetti emodinamici e cardiovascolari di due EM ravvicinate (applicate ad intervallo di 10 minuti l’una dall’altra) nei ratti SHR adulti ed anziani. A livello cerebrale è stata valutata la risposta delle arteriole di ordine 2 in termini di variazione del diametro, sia nell’area parietale, dove proiettano le afferenze trigeminali, sia nell’area frontale, presa come esempio di area cerebrale non direttamente coinvolta nell’elaborazione delle afferenze trigeminali.

A livello parietale, nei ratti adulti (n = 3), le arteriole hanno mostrato un progressivo aumento del loro diametro rispetto alla baseline (24,5 ± 1,77 μm) a partire da EM1 per raggiungere un plateau con valori del diametro significativamente maggiori rispetto alla baseline che si sono mantenuti attorno a 30,6 ± 3,50 μm (Fisher post-hoc test: p < 0,01), valore registrato al termine di EM2, per tutto il periodo di osservazione post-EM2 protratto fino a 240 minuti (30,9 ± 3,47 μm) (○ in Figura 4.5A).

Nei ratti SHR anziani (n = 3), nelle prime fasi sperimentali le arteriole non hanno mostrato variazioni del diametro e solo dopo EM2 hanno mostrato un tendenziale incremento di diametro che però non ha mai raggiunto la significatività statistica per tutto il restante periodo di osservazione (● in Figura 4.5A).

Nell’area frontale, nei ratti SHR adulti (n = 3) le variazioni di diametro delle arteriole di ordine 2 hanno mostrato un andamento sovrapponibile a quello riscontrato nell’area parietale: il progressivo incremento di diametro osservato nelle prime fasi sperimentali (baseline: 23,7 ± 0,50 μm) ha raggiunto un plateau al termine di EM2 (27,0 ± 0,77 μm, Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs baseline) con valori pressoché costanti per l’intero periodo di osservazione (a 240 minuti, diametro: 27,3 ± 1,17 μm, Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs baseline) (○ in Figura 4.5B).

A differenza di quanto riscontrato nell’area parietale, nell’area frontale le arteriole dei ratti SHR anziani (n = 3), hanno mostrato un progressivo incremento del diametro (baseline: 23,6 ± 0,50 μm) a partire da EM1 raggiungendo un plateau dopo EM2 (24,5 ± 0,50 μm, Fisher post-hoc test: p < 0,001 vs baseline) con valori significativamente incrementati rispetto alla baseline fino al termine del periodo di osservazione (a 240 minuti, diametro: 26,2 ± 0,55 μm) (● in Figura 4.5B).

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Figura 4.5 Confronto tra i diametri misurati nei ratti SHR adulti ed anziani,

nell’area parietale (A) e nell’area frontale (B). * p<0,05 vs baseline; ** p < 0,001 vs baseline

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Come controllo sono stati considerati ratti SHR adulti o anziani sottoposti alla sola procedura chirurgica (sham operated, SO) e mantenuti sotto osservazione per un periodo di 300 minuti, corrispondente alla durata complessiva degli esperimenti di EM ripetuta.

Sia i ratti SO adulti (n = 3) sia il ratto SO anziano non hanno mostrato alcuna significativa variazione dei diametri, né a livello dell’area parietale (Figura 4.6A), né di quella frontale (Figura 4.6B) per tutto il periodo di osservazione, ma solo la normale vasomotion, ovvero le oscillazioni del tono arteriolare dovute alle diverse attività (cardiaca, respiratoria, neurogena, miogenica ed endoteliale) che interagiscono tra loro sinergicamente.

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Figura 4.6 Confronto tra i diametri misurati nei ratti SHR SO adulti e nel ratto

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In tutti i ratti studiati sono state misurate la pressione arteriosa media (PAM) e la frequenza cardiaca (FC). La figura 4.7A mostra l’andamento di PAM nei 3 ratti SHR adulti (□) a confronto con l’andamento di PAM nei 3 ratti SHR anziani (■). In entrambi i gruppi di animali PAM è diminuita in modo marcato fino a 20 minuti post-EM2 per mantenersi poi significativamente ridotta rispetto al valore basale per tutto il periodo di osservazione. Nei ratti adulti dal valore di 189,33 ± 1,78 mmHg PAM si è ridotta al valore di 161,00 ± 3,24 a 240 minuti post-EM2 (Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs baseline) raggiungendo il nadir dell’effetto (160,33 ± 4,02 mmHg) a 120 minuti post-EM2 (Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs

baseline). Nei ratti anziani, dal valore di 179,00 ± 2,12 mmHg PAM si è ridotta al

valore di 151,00 ± 3,08 mmHg, (Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs baseline) a 240 minuti post-EM2 raggiungendo il nadir dell’effetto (150,33 ± 3,34 mmHg) a 60 minuti post-EM2 (Fisher post-hoc test: p < 0,05 vs baseline).

In figura 4.7B è messo a confronto l’andamento di FC registrato nei ratti adulti (Δ) con quello registrato nei ratti anziani (▲). Mentre nei primi FC non ha mostrato variazioni significative rispetto alla baseline, nei ratti anziani si è osservato un marcato effetto bradicardico: dalla baseline di 331,00 ± 2,94 bpm FC è progressivamente diminuita fino a stabilizzarsi su valori significativamente minori a partire da 20 minuti post-EM2 (292,67 ± 4,55 bpm, Fisher post-hoc test: p < 0,05) e per tutto il periodo di osservazione (a 240 minuti: 290,33 ± 2,86 bpm, p < 0,05).

Gli animali SHR SO non hanno mostrato alcuna significativa variazione di PAM ed FC per l’intero periodo di osservazione (dati non mostrati).

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Figura 4.7 Confronto tra le variazioni di PAM (A) ed FC (B) nei ratti adulti ed

anziani sottoposti a due EM ravvicinate. * p < 0,05 vs baseline

A

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4.3 VASOMOTION

Le ritmiche oscillazioni del diametro delle arteriole piali di ordine 2 sono state analizzate mediante analisi di Fourier (vedi Materiali e Metodi, paragrafo 3.6) in tracciati della durata di 30 minuti durante il periodo di osservazione basale (1) e nel periodo post-EM2 (2).

Nei ratti SHR adulti (n = 3), nell’area parietale, dopo applicazione delle due EM (Figura 4.8A2), si è osservato un significativo incremento delle componenti a bassa frequenza relative all’attività endoteliale (p < 0,001 per ULF; p < 0,01 per VLF), mentre le componenti relative all’attività miogenica (LF), respiratoria (HF) e cardiaca (VHF) hanno subito un significativo decremento (p < 0,01 per LF; p < 0,05 per HF; p < 0,001 per VHF) rispetto ai valori di frequenza osservati in condizioni basali (Figura 4.8A1). La componente relativa all’attività neurogenica è stata la sola a non subire variazioni. Negli stessi ratti, nell’area frontale, dopo applicazione delle due EM (Figura 4.8B2), si è osservato un significativo aumento della componente relativa all’attività endoteliale NO-dipendente (VLF) e di quella legata all’attività miogenica (LF) (p < 0,01 per VLF; p < 0,05 per LF). La componente a più alta frequenza relativa all’attività cardiaca (VHF) ha subito, invece, un significativo decremento (p < 0,01) rispetto alle condizioni basali (Figura 4.8B1).

È stata eseguita l’analisi spettrale delle sei componenti che caratterizzano le variazioni del diametro arteriolare anche su un ratto SHR anziano allo scopo di osservarne l’andamento. Nell’area parietale, dopo applicazione delle due EM (Figura 4.9A2), si è osservato un incremento delle tre componenti a bassa frequenza relative all’attività endoteliale e all’attività neurogenica (ULF, VLF e ILF), mentre la componente ad alta frequenza legata all’attività cardiaca (VHF) ha subito un decremento rispetto alle frequenze osservate in condizioni basali (Figura 4.8A1). Per quanto riguarda l’area frontale (Figura 4.9B2), tutte le 4 componenti a minor frequenza (ULF, VLF, ILF ed LF) hanno subito un tendenziale incremento, ma la componente che variava in modo più evidente è stata quella relativa all’attività cardiaca (VHF), per la quale è stato osservato un decremento rispetto alle condizioni basali (Figura 4.9B1).

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Figura 4.8 Percentuale della potenza delle 6 bande di frequenza, con il

corrispondente spettro di potenza tempo-dipendete (PSD: μm2/Hz), relative alle attività: endoteliale NO-indipendente (ULF), NO-dipendente (VLF), neurogenica (ILF), miogenica (LF), respiratoria (HF) e cardiaca (VHF), nell’area parietale (A) e frontale (B), in ratti SHR adulti sottoposti a due EM ravvicinate. 1: periodo basale; 2: periodo post-EM2.

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Figura 4.9 Percentuale della potenza delle 6 bande di frequenza, con il

corrispondente spettro di potenza tempo-dipendete (PSD: μm2/Hz), relative alle attività: endoteliale NO-indipendente (ULF), NO-dipendente (VLF), neurogenica (ILF), miogenica (LF), respiratoria (HF) e cardiaca (VHF), nell’area parietale (A) e frontale (B), nel ratto SHR anziano sottoposto a due EM ravvicinate. 1: periodo basale; 2: periodo post-EM2.

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4.4 ANALISI TRASCRIZIONALE

Gli effetti indotti da due EM ravvicinate coinvolgono aree che non sono direttamente implicate nell’elaborazione delle afferenze trigeminali, suggerendo fortemente che tali effetti siano dovuti alla modulazione da parte di EM di meccanismi sistemici di controllo della pressione arteriosa. Tra questi c’è il sistema renina-angiotensina (RAS). Come primo approccio allo studio di questi aspetti, nei ratti SHR adulti sottoposti a due EM ravvicinate e nei ratti SHR adulti SO dai quali sono stati ottenuti i dati emodinamici, è stata anche valutata l’espressione genica dei principali recettori di Ang II, AT1R e AT2R, e dell’enzima ACE. Inoltre, è stato preso in considerazione anche il ramo protettivo di RAS, conducendo l’analisi dell’espressione genica di MAS1, recettore di Ang (1-7) e dell’enzima ACE2.

L’analisi è stata eseguita sia sul tessuto cerebrale dell’area parietale sia in quello dell’area frontale.

I dati raccolti hanno mostrato che i livelli di espressione dei geni codificanti per AT1R e AT2R non erano significativamente differenti nei ratti sottoposti a due EM ravvicinate rispetto ai ratti SO, sia nell’area parietale (Figura 4.10A) sia nell’area frontale (Figura 4.10B). I livelli di espressione del gene per ACE, nell’area parietale, sono risultati significativamente maggiori (p < 0,001) nei ratti sottoposti ad EM rispetto ai ratti SO, mentre nell’area frontale i livelli di espressione non differivano significativamente nei due gruppi di animali. L’espressione del gene per MAS1 si è rivelata marcatamente differente tra i ratti sottoposti a due EM e i ratti SO: nei primi l’espressione del gene per MAS1 è risultata significativamente minore (p < 0,001) nell’area parietale e significativamente maggiore nell’area frontale (p < 0,01). Infine, i livelli di espressione per il gene codificante per ACE2 non sono risultati significativamente differenti nell’area parietale tra i ratti sottoposti ad EM e i ratti SO, mentre nell’area frontale l’espressione era significativamente maggiore nei ratti sottoposti a due EM rispetto ai ratti SO ( p < 0,05).

Un dato interessante è che nei ratti SO l’espressione del gene per AT1R è risultata significativamente minore nell’area parietale, rispetto all’area frontale (p < 0,01), e l’espressione del gene per MAS1, al contrario, è risultata significativamente maggiore nell’area parietale rispetto all’area frontale (p <

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0,001). Inoltre, nell’area parietale l’espressione del gene codificante per MAS1 è risultata significativamente maggiore rispetto all’espressione del gene per AT1R (p < 0,0001), mentre nell’area frontale è l’espressione del gene codificante per AT1R ad essere significativamente maggiore rispetto all’espressione del gene per MAS1 (p < 0,05).

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Figura 4.10 Confronto dell’espressione dei geni codificanti per AT1R, AT2R,

ACE, MAS1 e ACE2 tra area parietale (A) e frontale (B) in ratti SHR adulti sottoposti a due EM ravvicinate e ratti SHR adulti SO.

A

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4.5 ANALISI PROTEICA

La marcata variazione di espressione del gene per il recettore MAS1 per Ang (1-7) osservata in risposta all’applicazione di due EM ravvicinate ha suggerito di valutare anche eventuali variazioni di espressione della proteina. Inoltre, sono stati valutati possibili cambiamenti dei livelli proteici del recettore AT1R per Ang II, che funzionalmente si contrappone a MAS1, e di AT2R che, pur legandosi ad Ang II, ha un comprovato effetto vasorilassante.

Sono stati sottoposti a Western Blotting campioni di tessuto cerebrale prelevati dai ratti da cui sono stati ottenuti i dati emodinamici.

I risultati mostrano che, nell’area parietale non c’erano variazioni significative dei livelli proteici di AT1R e AT2R tra i ratti SHR SO ed i ratti SHR sottoposti a due EM ravvicinate. Nel caso di MAS1, invece, sono stati osservati livelli proteici significativamente minori nei ratti SHR sottoposti a due EM ravvicinate rispetto ai ratti SO (p < 0,05) (Figura 4.11).

Nell’area frontale, i livelli proteici di AT1R e AT2R sono risultati significativamente minori nei ratti SHR sottoposti a due EM ravvicinate rispetto ai ratti SHR SO (p < 0,01 per AT1R; p < 0,001 per AT2R). I livelli proteici di MAS1, invece, non hanno mostrato differenze significative (Figura 4.12). Inoltre, nei ratti sottoposti a due EM ravvicinate, i livelli proteici di MAS1 sono risultati significativamente maggiori rispetto ai livelli proteici di AT1R (p < 0,05).

Infine, nei ratti sottoposti ad EM, i livelli proteici di AT1R e AT2R sono risultati significativamente minori nell’area frontale rispetto all’area parietale (p < 0,05 in entrambi i casi).

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Figura 4.11 Livelli proteici di AT1R, AT2R e MAS1 valutati nell’area parietale

dei ratti SHR adulti sottoposti a due EM ravvicinate e dei ratti SHR SO. A: istogramma delle densità ottiche: i valori riportati per le proteine target sono stati normalizzati alle densità ottiche misurate per le proteine di riferimento (GAPDH e HPRT). B: blots.

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Figura 4.12 Livelli proteici di AT1R, AT2R e MAS1 valutati nell’area frontale

dei ratti SHR adulti sottoposti a due EM ravvicinate e dei ratti SHR SO. A: istogramma delle densità ottiche: i valori riportati per le proteine target sono stati normalizzati alle densità ottiche misurate per le proteine di riferimento (GAPDH e HPRT). B: blots.

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