Elettroforesi del siero e proteine totali

L’elettroforesi è una metodica di laboratorio che sfrutta la proprietà delle proteine seriche e/o plasmatiche di migrare in un campo elettrico se depositate su un supporto solido o liquido. Più particolarmente, sfrutta la proprietà delle molecole proteiche di ionizzarsi in una soluzione a pH differente dal loro punto isoelettrico e di spostarsi nel campo elettrico verso l’anodo o il catodo, formando singole frazioni proteiche o bande a seconda della loro carica elettrica, forma, peso e dimensione delle singole molecole. Le singole frazioni proteiche fissate su un supporto solido vengono lette a un fotometro che ne disegna un grafico detto protidogramma (Ubaldi et al., 1982).

Le proteine del siero sono (Bizzeti, 1995):

• Albumina (P.M. 66.300) trasporta proteine e vitamina A; diminuisce

nelle malattie epatiche e nelle sindromi nefrosiche; regola la

pressione oncotica, trasporta ac. grassi, ac. biliari, farmaci, istamina e oligoelementi

• Glicoproteine (proteine coniugate con carboidrati) γglobuline,

α2macroglobulina, ceruloplasmina, aptoglobulina, sieromucoide. Aumentano nelle flogosi acute

• Transferrina (P.M. 72.000-90.000) trasporta il ferro, ha attività

antibatterica e antivirale, aumenta nelle deficienze di ferro e nella gravidanza, diminuisce nelle malattie epatiche, infezioni acute e croniche attive

• Aptoglobulina e Emopessina (P.M. 90.000 e 57.000) la prima si lega

all’Hgb libera e l’altra trasporta l’ematina (Hgb senza gruppo eme) al fegato. Diminuiscono nell’anemia emolitica e nell’eritropoiesi

inefficace. L’aptoglobulina aumenta in corso di traumi, tumori e processi infiammatori

• Ceruloplasmina (P.M. 124.000-134.000) trasporta il Rame e

mobilita il Ferro. Aumenta nelle fasi acute delle infezioni batteriche e virali e nelle parassitosi. Diminuisce nella malnutrizione, nel malassorbimento e nella nefrosi

• Proteina C reattiva (P.M. 21.000) regla i processi infiammatori e le

difese attivando il complemento, promuovendo la fagocitosi, inibendo l’aggregazione piastrinica, stimolando i linfociti T. Aumenta nei processi infiammatori e nelle infezioni

• Lipoproteine trasportano lipidi, gliceridi e colesterolo

• Immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) responsabili

dell’immunità umorale. Hanno catene pesanti e leggere unite da un ponte disolfuro

Tabella 3.1. Le proteine del siero (senza albumina)

α1globuline α2globuline β1globuline β2globuline

γ- globuline α1antichimotripsina α2macroglobulina transferrina fattore C3 IgG

α1antitripsina aptoglobulina emopessina (IgM) IgM

α1lipoproteina ceruloplasmina βlipoproteina (IgA) IgA

proteina C reattiva pre-β-

lipoproteina (IgE)

sieroamiloide A

orosomucoide

Fin dagli anni ‘80 l’Elettroforesi Siero Proteica (ESP) è stata proposta come parametro fondamentale sia per la diagnosi della leishmaniosi sia per la valutazione del miglioramento nei soggetti sottoposti a trattamento (Ceci et al., 1985) e, quindi, per la determinazione della sospensione della terapia (Bizzeti et al., 1989).

Nell’approccio diagnostico alla leishmaniosi un importante strumento di indagine è rappresentato dalla misurazione quantitativa e qualitativa della protidemia: dosaggio della protidemia totale (PT), rapporto albumina/globulina (A/G) ed elettroforesi delle proteine seriche (protidogramma).

Nei cani malati la protidemia totale aumenta e ciò è legato essenzialmente ad una diminuzione dell’albumina e ad un aumento delle β e γ-globuline (talvolta anche delle α 2-globuline), con una conseguente variazione del rapporto A/G che risulta, quindi, inferiore alla norma (Reis et al., 2006).

L’ipoalbuminemia è conseguente alla nefropatia, all’enteropatia proteino-disperdente, ai processi flogistici ed alla diminuita sintesi epatica che accompagnano e spesso caratterizzano il corteo sintomatologico della leishmaniosi.

L’iper-β-globulinemia è legata alla migrazione in questa banda elettroforetica di alcune immunoglobuline (IgM, IgA), del fattore C3 del complemento, del fibrinogeno e della transferrina.

L’iper-γ-globulinemia che si sviluppa nel corso della malattia è il frutto dell’attivazione policlonale dei linfociti B, che producono quantità abnormi di immunoglobuline per lo più aspecifiche.

La fusione delle β e γ-globuline in un picco policlonale indica una produzione eterogenea di immunoglobuline aspecifiche.

Nei casi disprotidemici il rapporto A/G è sempre inferiore a 0,60. Tale disprotidemia è essenzialmente dovuta ad una diminuzione dell’albumina, ad un aumento delle β e γ - globuline e talvolta delle α2 - globuline.

In presenza di riacutizzazioni della malattia, o di forme acute di processi flogistici concomitanti, può essere presente un innalzamento delle

α-2-globuline, banda elettroforetica in cui migrano le cosiddette “proteine

della fase acuta della flogosi” (aptoglobulina, α-2-macroglobulina, ceruloplasmina). Un alto picco delle α2-globuline può anche conseguire ad un interessamento renale. Le α2-globuline sono indicative, se superano i due terzi dell’altezza dell’albumina, di una riacutizzazione della malattia o

della presenza di un focolaio di necrosi; la persistenza di un alto picco durante il trattamento e/o la ricomparsa in periodo di remissione, è sempre indice di uno stato di guarigione instabile (Bizzeti, 1996).

Nel protidogramma di un cane affetto da leishmaniosi si osserva generalmente un tipico “picco beta-gamma”. L’importanza del protidogramma nel corso del procedimento clinico a proposito della malattia in discussione, riguarda particolarmente la possibilità di ottenere una diagnosi precoce (anche in assenza di sintomi oggettivi) e di poter emettere un giudizio prognostico più o meno favorevole tenendo presente che si ha una normalizzazione del tracciato elettroforetico dopo 25 – 45 giorni dalla guarigione clinica.

È importante monitorare il tracciato elettroforetico durante e dopo la terapia medica al fine di valutare lo stato della malattia, in quanto questo tipo di analisi ci può far valutare l’andamento della malattia stessa (Bizzeti, 1996).

Quando la rilevazione della protidemia indica un’ipoalbuminemia, soprattutto con PT superiori a 7 g/dl (od a 8), ed un aumento delle β e γ - globuline, si deve stabilire un forte sospetto di leishmaniosi (Bizzeti et al., 1989).

In molti casi le modificazioni elettroforetiche sono più precoci e meno persistenti delle reazioni sierologiche; esse permetterebbero perciò un trattamento meglio adattato allo stato evolutivo della malattia.

In conclusione il protidogramma risulta essere un mezzo utile in corso di leishmaniosi del cane per:

la diagnosi: nei casi in cui la sintomatologia sia insolita, per cui il protidogramma assumerebbe l’importanza di segnale precoce ed evidente di allarme;

la prognosi: per localizzare lo stadio evolutivo della malattia e svelare eventuali complicazioni;

Fig. 3.1. Alcuni esempi di tracciati elettroforetici

L’impiego del protidogramma in modo sistematico nell’evoluzione clinica dell’animale trattato, risulterebbe essere un mezzo per mantenere l’infezione ad un livello sufficientemente basso. Così si potrebbe evitare che l’animale, in attesa di una nuova ricaduta diventi una riserva potenziale di agente infettante e quindi un pericolo permanente per la comunità; è necessario pertanto considerare il protidogramma, nell’ambito della leishmaniosi del cane, un mezzo indispensabile di prevenzione e di controllo (Bizzeti, 1996).

In disaccordo con quanto appena scritto, si riporta un recente intervento di Paolo Bianciardi al Secondo Congresso Internazionale SCIVAC sulla Leishmaniosi canina (Pisa, 17 aprile 2010).

“Negli ultimi decenni la normalizzazione del quadro proteico elettroforetico e del rapporto A/G è stata indicata come un punto chiave per stabilire l’interruzione della terapia anti-Leishmania e per monitorarne l’efficacia (Ceci, 1985; Bizzeti, 1989).

Tuttavia esiste una grande variabilità nei valori delle frazioni proteiche elettroforetiche del cane. Inoltre, malattie infettive, non infettive e parassitosi possono influenzare la fluttuazione di tali frazioni proteiche. Alcuni Autori hanno evidenziato una diretta connessione tra titoli anticorpali e l’elettroforesi delle sieroproteine (Amusategui, 2003).

Altri Autori (Ginel et al., 1998; Solano-Gallego et al., 2001) hanno rilevato come non esista correlazione tra i titoli sierici alla diagnosi e la gravità dei segni clinici né esista una correlazione tra l’andamento dei titoli sierici e la remissione dei segni clinici, durante il trattamento ed il follow-up (Mancianti e Meiani, 1988).

Al contrario molti cani mostrano titoli anticorpali elevati anche diversi mesi dopo un efficace trattamento (Mateo et al., 2009).

La ragionevole conseguenza è che i titoli sierologici non hanno un valore prognostico. La valutazione della correlazione tra la normalizzazione nel tempo del rapporto A/G ed il miglioramento del quadro clinico non ha mostrato alcun rapporto statisticamente significativo.

Sulla base dei dati ottenuti, il rapporto A/G non risulta né un parametro indicativo dell’efficacia del trattamento terapeutico né un valido strumento per la determinazione dell’interruzione della terapia. La valutazione dell’efficacia terapeutica del trattamento per Leishmania dovrà dunque tornare all’impiego di accurate valutazioni cliniche, ematobiochimiche e, visti i risultati delle recenti valutazioni tossicologiche degli antimoniali sui reni del cane, della funzionalità renale” (Bianciardi, 2010).