EMOGRAMMA

Dai risultati dell’emogramma emerge una differenza significativa per i parametri MCV e MCHC. Tali differenze sono fondamentalmente dovute alla scelta di non considerare i valori di RBC e MCV nei campioni che presentavano autoagglutinazione per il gruppo “Texas”; quindi il numero dei campioni di tale gruppo si è notevolmente ridotto, passando da 43 a 13. Però questi parametri sono difficilmente comparabili a causa dei limiti derivanti dall’autoagglutinazione.

L’anemia non ha mostrato differenze significative per gravità , in quanto in entrambi i gruppi prevalgono le forme moderata e grave, in accordo con la letteratura6,7,11,14,62,73,76,77.

Per la tipologia di anemia, non è possibile discutere i risultati ottenuti, data l’impossibilità di eseguire una classificazione per la maggior parte dei soggetti del gruppo “Texas”, dovuta all’assenza del valore di MCV. Nonostante ciò nel gruppo “Tuscany” è risultata una netta prevalenza della forma macrocitica ipocromica.

Sulla base dell’IR l’anemia è risultata più frequentemente rigenerativa in entrambi i gruppi senza alcuna differenza. Non è stato possibile classificare l’anemia sulla base della conta assoluta reticolocitaria poiché, nel gruppo “Texas”, nella maggior parte dei soggetti mancava il parametro RBC. Sia la tipologia dell’anemia in base agli indici corpuscolari medi, sia il grado di rigenerazione riflettono quanto riportato in letteratura, secondo cui l’anemia nella maggior parte dei casi è macrocitica ipocromica e rigenerativa1,2,11,14. Infatti, un’anemia rigenerativa è solitamente macrocitica ipocromica, considerando le dimensioni maggiori e il contenuto emoglobinico minore dei reticolociti rispetto agli eritrociti maturi79 .

Per la conta piastrinica, è stato valutato il valore strumentale e le valutazioni del microscopista per la stima di aggregati piastrinici. Quando gli aggregati piastrinici sono presenti rendono meno attendibile il valore del contaglobuli automatico. Pur non essendo risultate differenze significative tra i due gruppi, si nota come l’alterazione più frequente sia rappresentata dalla trombocitopenia, come riportato in letteratura4,7,9,58,62. Da questi studi risulta che la percentuale di pazienti con IMHA trombocitopenici si

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attesti tra il 67% e l’85%, che invece si discosta da quanto rilevato nel nostro studio (41,6% nel gruppo “Tuscany” e 55,8% nel gruppo “Texas”).

Per i leucociti è stata riscontrata una significatività nella frequenza di osservazione e nella conta degli eosinofili, rispettivamente più frequente e in numero maggiore nel gruppo “Texas”. È emersa una differenza anche per il numero dei linfociti; la mediana del gruppo “Tuscany” risulta superiore rispetto a quella del gruppo “Texas”. La maggior percentuale di soggetti linfopenici, osservata nel gruppo “Texas”, è da riferire probabilmente ad una terapia corticosteroidea più prolungata.

Tra le alterazioni leucocitarie rinvenute, l’unica che presenta una differenza significativa tra i due gruppi è la frequenza di osservazione di monocitosi nel gruppo “Texas”; anche in questo caso una plausibile spiegazione può essere data dal fatto che questi pazienti vengono portati in una fase già avanzata della patologia. Non è stato possibile eseguire un confronto per quanto riguarda la valutazione qualitativa dei monociti, poiché nei referti del gruppo “Texas” questa non era presente. Inoltre, poiché nel gruppo “Texas” è stata riscontrata una maggiore percentuale di emolisi (vedi dopo), ciò potrebbe comportare un carico di detriti maggiore da smaltire e quindi un numero di monociti reclutati, adibiti a questo compito, più alto.

I risultati delle principali alterazioni leucocitarie riscontrate concordano con quanto riportato in letteratura, secondo cui è comune evidenziare una marcata leucocitosi neutrofilica con spostamento a sinistra11,14,73,82,83 _{e una monocitosi}1,15,85,86 _{in corso di} IMHA.

12.5.2 ALTERAZIONI MORFOLOGICHE ERITROCITARIE

Per la sferocitosi è stata riscontrata una differenza significativa tra i due gruppi, in quanto il gruppo “Texas” presentava un maggior numero di soggetti con tale alterazione (88,4% vs 66,6%). Essendo stata definita come criterio di inclusione, la sferocitosi è sicuramente più frequente in questo gruppo, rispetto al gruppo “Tuscany”, dove per altro sono stati presi in considerazione anche quei casi dove la ricerca degli anticorpi antieritrocitari era risultata positiva anche in assenza di sferocitosi. Poiché gli sferociti sono il risultato di un’attività fagocitaria sui globuli rossi, possono essere presenti anche in altre condizioni patologiche, come nella sindrome emofagocitica e nell’emolisi indotta dallo zinco, sebbene in numero inferiore rispetto all’IMHA (1+ contro 2+)2_. Sono stati inoltre associati all’avvelenamento da morso di serpente o da puntura d’ape

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nel cane30,121 _{e sono stati riportati nei Basenji con carenza di piruvato chinasi}122_{. Infine,} gli sferociti possono essere causati anche da un difetto molecolare in una o più delle proteine del citoscheletro degli eritrociti (ad es. spectrina)116,123. Pur non essendo patognomonici, comunque, gli sferociti sono fortemente indicativi di IMHA nel cane, soprattutto se presenti in numero significativo (2+ o superiore) e se associati all’autoagglutinazione7,11,14,119_{. Infatti in vari studi retrospettivi, il 90% circa dei cani} con IMHA presentava sferociti nello striscio ematico, benché nel cane con emolisi iperacuta possano essere in numero scarso2. In conclusione è possibile riscontrare IMHA con DAT positivo in assenza di sferocititosi o soggetti con sferocitosi non affetti da IMHA; da qui la necessità di eseguire sia una ricerca degli anticorpi antieritrocitari, sia una valutazione morfologica dello striscio ematico.

Le altre alterazioni prevalentemente riscontrate (policromasia, anisocitosi e presenza di corpi di Howell-Jolly) sono concordi con la letteratura e caratterizzano un’anemia di tipo rigenerativo6,7,11,14.

12.5.3 RATIO LEUCOCITARI E PIASTRINICI

Per l’NLR è emersa una differenza molto significativa tra i due gruppi, con valori più elevati nel gruppo “Texas”; poiché tale parametro può essere aumentato a causa di un incremento del numero dei neutrofili e/o una diminuzione del numero dei linfociti223_, tale differenza può essere spiegata con la maggior percentuale di soggetti linfopenici riscontrata nel gruppo “Texas”.

Per l’NER è emersa una significatività molto marcata tra i due gruppi, con valori più elevati nel gruppo “Tuscany”; poiché tale parametro può essere aumentato a causa di un incremento del numero dei neutrofili e/o una diminuzione del numero degli eosinofili, tale differenza può essere spiegata anche in questo caso con la significatività tra i due gruppi già riscontrata nel numero di eosinofili.

Anche per l’LMR è stata evidenziata una differenza significativa, con valori più elevati nel gruppo “Tuscany”. Poiché tale parametro può essere diminuito a causa di una riduzione del numero dei linfociti e/o un aumento del numero dei monociti, la significatività può essere spiegata con la maggior frequenza di osservazione di entrambe le alterazioni nel gruppo “Texas”.

Infine, anche per il PLR si è riscontrata una differenza significativa, con valori più elevati nel gruppo “Texas”. Poiché tale parametro può essere aumentato a causa di un

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incremento del numero delle piastrine e/o una diminuzione del numero dei linfociti, la significatività può essere spiegata con la maggior percentuale di soggetti linfopenici riscontrata nel gruppo “Texas”, in quanto in relazione alle piastrine non sono state individuate differenze tra i due gruppi.

Ad oggi in veterinaria sono pochi gli studi che attestano l’utilità predittiva di tali ratio; in particolare lo studio di M. J. Macfarlane et al. del 2016, sull’utilizzo dell’NLR per predire il grado istopatologico del mastocitoma canino, ipotizza che ad un maggior valore di NLR possa essere associato un mastocitoma di alto grado240, presentando quindi una buona abilità discriminatoria nel distinguere tra mastocitoma di alto e basso grado. Nel presente studio la differenza statistica riscontrata per questo parametro ci permette di evidenziare come in soggetti con condizioni cliniche più gravi, quali lo erano quelli del gruppo “Texas”, l’NLR fosse più elevato, a sostegno dell’ipotesi presentata dall’articolo sopracitato. La mediana e l’intervallo di riferimento del ratio relativi al mastocitoma di alto grado (9,15, 3,83-29,07) differiscono da quelli riscontrati nel nostro studio per il gruppo “Texas” (17, 3,7-46), presentandosi molto più elevati. Similmente lo studio di L. Macfarlane at al. del 2015, relativo all’NLR nel sarcoma dei tessuti molli, si proponeva di valutare se l’NLR potesse essere utile nella differenziazione preoperatoria di sarcomi dei tessuti molli (STS) da tumori benigni dei tessuti molli (BSTT)94_{. Dai risultati emerge chiaramente come l’NLR pretrattamento sia} significativamente più alto nei STS, rispetto ai BSTT, andando a confermare i risultati del nostro studio. Negli studi sopracitati l’innalzamento dell’NLR è determinato da neutrofilia e/o linfopenia, a causa della risposta infiammatoria sistemica innescata dal tumore; tale condizione di infiammazione si ritrova anche in corso di IMHA11,14,73,82,83, e ci permette quindi di ipotizzare un utilizzo di tale parametro come fattore predittivo negativo anche in una patologia non neoplastica, quale l’IMHA.

Sebbene in medicina veterinaria non siano ancora stati studiati approfonditamente i NER, LMR e PLR, in medicina umana sono diversi gli studi che li trattano223-239, nonostante in entrambi i casi vengano principalmente utilizzati come fattori prognostici in pazienti neoplastici. In particolare lo studio di Lu et al. del 2017230 mette in correlazione i ratio NLR, LMR e PLR in pazienti con carcinoma nasofaringeo, evidenziando come un NLR ≥ 2,28, un LMR< 2,26 e un PLR ≥ 174, valori considerati quindi come cut-off per la distinzione tra carcinoma di basso e alto livello, siano significativamente associati ad una sopravvivenza relativamente ridotta; le mediane più

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elevate riscontrate nel gruppo “Texas” del nostro studio rispetto a quelle del gruppo “Tuscany”, potrebbero quindi essere indicative di una situazione clinica più grave. In conclusione tali ratio risultano utili soprattutto in quanto riducono l’impatto delle fluttuazioni di entrambe le variabili prese in considerazione , come sostenuto da uno studio di medicina umana di Szkandera et al. del 2013, che associa un elevato NLR preoperatorio ad una prognosi negativa in pazienti con sarcoma dei tessuti molli242.

12.5.4 PROFILO COAGULATIVO

Il profilo coagulativo al momento della prima visita è stato eseguito in 43 soggetti appartenenti al gruppo “Tuscany” e in 27 soggetti appartenenti al gruppo “Texas”. Dal confronto tra i due gruppi emerge una differenza significativa per quanto riguarda il PT; infatti nel gruppo “Texas” è presente una percentuale molto elevata (48,2%) di soggetti con alterazione di tale valore, contro un 4,7% del gruppo “Tuscany”; quest’ultimo dato probabilmente è dovuto all’ampio intervallo di riferimento (5,5-11,4 sec). La quasi totalità di queste alterazioni è rappresentata da una trombocitopenia, come riportato in letteratura, dove è stato riscontrato che i cani con IMHA presentano un PT aumentato nel 50% dei casi4,7,9,58_{. La differenza rilevata tra i due gruppi potrebbe essere legata} anche questa volta alla peggiore condizione clinica in cui i soggetti del gruppo “Texas” versavano al momento della presentazione oppure essere dovuta al numero minore di soggetti presi in esame (solamente 27 dei 43 soggetti inclusi nello studio). In ogni caso, poiché l’IMHA predispone gli animali all’ipercoagulabilità e di conseguenza allo sviluppo di CID, è sempre consigliato l’approfondimento della valutazione del profilo coagulativo9.

12.5.5 PROFILO BIOCHIMICO

Dall’analisi statistica emerge una differenza significativa per la frequenza di osservazione di emolisi nel plasma; nel gruppo “Texas” questa era presente nel 58,1% dei soggetti, contro un 16,7% del gruppo “Tuscany”; anche l’ittero è risultato ben rappresentato14,73 (45,8% vs 44,2%). L’emolisi, in particolare, interferisce nelle indagini spettrofotometriche, ed altera la concentrazione di alcune sostanze, aumentando quella degli analiti contenuti negli eritrociti. Nell’IMHA, l’emolisi è parte integrante del processo patogenetico, quindi, nel presente studio è stata considerata un’interferenza

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solo per i seguenti test spettrofotometrici: aumento dell’urea e del fosforo, diminuzione della creatinina, della bilirubina totale e del calcio. L’ittero, invece, incide principalmente sull’aumento della bilirubina243. La differenza riscontrata nella frequenza di osservazione di emolisi può essere ricondotta a un più avanzato stadio della patologia nei soggetti del gruppo “Texas”.

Per le proteine totali, si è visto come la differenza significativa tra i due gruppi sia dovuta ad una maggiore iperproteinemia del gruppo “Texas”, dovuta principalmente ad un aumento della frazione delle globuline, anch’esse statisticamente differenti nei due gruppi. L’iperproteinemia può essere causata dall’emoglobinemia derivante dall’emolisi intravascolare, dall’incremento delle gamma-globuline e dall’aumentata concentrazione delle proteine infiammatorie della fase acuta, come aptoglobina, proteina C-reattiva e fibrinogeno93. Tutti questi fattori possono avere valori aumentati nel gruppo “Texas”, per la peggiore condizione in cui versavano i pazienti al momento del loro arrivo. La significatività riscontrata tra i due gruppi per l’AGR è dovuta ad un aumento delle globuline, per cui il ratio risulta significativamente inferiore nel gruppo “Texas”. La riduzione di tale parametro è associata a condizioni infiammatorie, pertanto risulta plausibile che la riduzione sia più marcata nel gruppo “Texas”, comprendente soggetti in condizioni cliniche peggiori. Tale risultato è concorde con la letteratura, in quanto lo studio di L. Macfarlane et al. del 201594 _{evidenzia come l’AGR sia significativamente} ridotto in cani con STS rispetto a cani con BSTT.

Per la bilirubina totale non è presente alcune differenza tra i due gruppi, in quanto in entrambi si evidenzia un incremento di tale parametro, concordemente con la letteratura. L’iperbilirubinemia, di origine pre-epatica ed epatobiliare, è stata ampiamente documentata in letteratura nei cani affetti da IMHA6,7,51,91,165.

Per il fosforo, la differenza significativa riscontrata è data dalla elevata percentuale di soggetti iperfosfatemici presente nel gruppo “Tuscany”. Poiché l’iperfosfatemia si può osservare in corso di ridotta filtrazione glomerulare, rottura della vescica, intossicazione da vitamina D, chetoacidosi diabetica o sindrome da lisi tumorale, e infine, fisiologicamente negli animali giovani243 e si ha una possibile interferenza dell’emolisi su di essa, a questa osservazione non è possibile attribuire un particolare significato. Per il calcio la differenza riscontrata tra i due gruppi è dovuta a valori più ridotti nel gruppo “Texas”; poiché, come abbiamo già accennato, i valori del calcio possono essere alterati dalla presenza di emolisi, soggetti con un maggiore grado di emolisi presentavano una diminuzione di questi valori.

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Per la creatinina si è evidenziata una differenza significativa tra i due gruppi, in particolare, mentre nel gruppo “Texas” tutti i valori rientravano nell’intervallo di riferimento, nel gruppo “Tuscany” 8 soggetti presentavano delle alterazioni (50% incremento vs 50% diminuzione). Tali variazioni possono essere addotte a numerosi fattori: presenza di emolisi, con conseguente diminuzione del valore di tale parametro, presenza di un danno renale secondario all’IMHA (danno renale indotto da ipossia, concomitante patologia renale tromboembolica) o fattori prerenali7.

Per gli enzimi epatici non abbiamo evidenziato alcuna significatività per la ALP e la GGT; in entrambi i gruppi la ALP risultava aumentata in una notevole percentuale di soggetti (80% gruppo “Tuscany” vs 90,7% gruppo “Texas”), concordemente con quanto riportato in letteratura, dove sono descritti livelli di ALP e ALT moderatamente elevati, in corso di IMHA6,58,62, conseguenti ad un danno epatico ipossico o ischemico14, o all’induzione enzimatica corticosteroidea di origine endogena e/o esogena. L’incremento della ALP è stato identificato come fattore prognostico negativo per i cani affetti da IMHA3. In relazione alla GGT invece gli aumenti non erano così importanti (28,3% vs 14%); l’attività sierica della GGT aumenta parallelamente a quella della ALP, ma tende ad aumentare principalmente in corso di colestasi (intra o extraepatica) e di induzione da steroidi243_{. Infine la ALT la differenza significativa riscontrata dipende} da una maggiore frequenza di osservazione di un aumento di tale parametro nel gruppo “Tuscany” (50%), rispetto al gruppo “Texas” (19,1%).

12.5.6 ESAME DELLE URINE

L’esame delle urine è stato eseguito in 32 cani appartenenti al gruppo “Tuscany” e in 32 cani appartenenti al gruppo “Texas”; in questi soggetti non sono stati eseguiti tutti i parametri, pertanto il numero dei campioni può variare da parametro a parametro. Inoltre va sottolineata la difficoltà nell’uniformare le unità di misura nei due gruppi. È stata riscontrata una differenza significativa per quanto riguarda il metodo di prelievo delle urine, essendo predominante nel gruppo “Texas” la raccolta mediante cistocentesi, mentre nel gruppo “Tuscany” la raccolta per minzione spontanea. Tale differenza è puramente descrittiva e implica un differente metodo di approccio nei due gruppi oggetto di studio.

Per quanto riguarda l’esame chimico è stata rilevata una differenza significativa nella presenza di proteinuria, evidenziata maggiormente nel gruppo “Texas”, con una

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percentuale dell’85,7%, contro un 56,6% del gruppo “Tuscany”. Questo dato può rispecchiare la differenza già riscontrata nel profilo biochimico, in relazione alla maggiore frequenza di osservazione di iperproteinemia nel gruppo “Texas”. La proteinuria dovrebbe essere sempre valutata in relazione al peso specifico, prendendo in considerazione anche il rapporto PU/CU, ma questo non è stato possibile confrontarlo, per la mancanza di tale parametro nei referti del gruppo “Texas”.

Anche la presenza di bilirubinuria differisce significativamente tra i due gruppi: 50% nel gruppo “Tuscany” vs 80,8% nel gruppo “Texas”; in quest’ultimo è presente inoltre in grado più marcato. La soglia renale per la bilirubina è bassa, infatti modici aumenti della sua concentrazione possono causare la comparsa di bilirubinuria, tanto da poterla identificare prima ancora della comparsa dell’iperbilirubinemia e dell’ittero243_{. Tuttavia,} la bilirubina rilevata nelle urine è solo la quota coniugata; quella non coniugata è legata alle albumine e in condizioni normali non passa la barriera glomerulare in quantità significativa86,243. Il presente studio non concorda con quello di Klag et al. del 1993 che

ha documentato un 14% di cani con livelli normali di bilirubina ma con presenza di bilirubinuria62, in quanto rispettivamente l’86,6% (“Tuscany”) e l’81% (“Texas”) dei soggetti aventi bilirubinuria presentavano contemporaneamente iperbilirubinemia. Un altro parametro che differisce significativamente tra i due gruppi è la presenza di sangue; in particolare questa è più frequente nel gruppo “Texas” con una percentuale del 93,3%, contro un 46,7% del gruppo “Tuscany”. La presenza di sangue può essere definita come ematuria e/o emoglobinuria, responsabili, rispettivamente, della colorazione rossastra delle urine e del plasma. Emoglobinuria ed emoglobinemia si riscontrano in caso di significativa emolisi intravascolare1,86, nonostante questa forma sia meno frequente rispetto alla forma extravascolare nei cani affetti da IMHA. È inoltre documentato nell’uomo che meno del 20% dei pazienti con AIHA mostra emolisi intravascolare, prevalendo appunto l’altra forma53_{. Tale differenza riscontrata tra i due} gruppi può essere associata alle peggiori condizioni cliniche in cui versavano i pazienti del gruppo “Texas” al momento della loro presentazione, implicando quindi un maggiore grado di emolisi, come già visto e discusso nella sezione relativa al profilo biochimico.

Per quanto riguarda l’esame del sedimento i due gruppi differiscono per la presenza di cellule squamose, più frequenti nel gruppo “Tuscany” (78,1% vs 35,3%). La presenza di cellule epiteliali, squamose per il 64-74%, ma anche di transizione per il 35-45% non assumono un particolare significato ai fini di questo studio.

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12.6 FATTORI PROGNOSTICI

Dai risultati ottenuti possiamo vedere come il nostro studio concordi con la letteratura per una serie di parametri. Possiamo innanzitutto fare riferimento al sistema di punteggio CHAOS, che associa un punteggio elevato, dato dalla combinazione di una serie di fattori, compresi età e temperatura, ad una prognosi peggiore162; come risulta dalla regressione logistica pertanto all’aumentare di tali parametri la probabilità di sopravvivenza si riduce. Per il peso corporeo non è stata individuata alcuna significatività, nonostante lo studio di Ishihara et al. del 2009159 _{correli un peso} superiore a 12 kg a una prognosi negativa, in quanto le razze di taglia grande sembrano essere maggiormente predisposte a sviluppare secondariamente tromboembolismo. Per la rigenerazione eritroide uno studio retrospettivo62 ha riportato un minor tasso di sopravvivenza nei cani che non avevano avuto una vigorosa risposta rigenerativa durante l’iniziale ospedalizzazione, come emerge dal nostro studio, sebbene studi successivi6,18 non confermino tale ipotesi.

Nello studio di Weinkle et al. del 20056 i cani con sferocitosi mostravano risultati clinico-patologici molto critici, non presentando però tassi di sopravvivenza significativamente ridotti. Ciò è in contrasto con quanto risulta dal nostro studio, per cui ad un aumento della sferocitosi corrisponde un aumento della probabilità di non sopravvivenza. Anche l’emolisi è stata associata ad una più elevata probabilità di non sopravvivenza, in quanto appare chiaro come la sua frequenza sia correlata ad una maggiore gravità della patologia.

Per la presenza di left shift il nostro studio sembra non concordare affatto con la letteratura, dove la neutrofilia con presenza di banda è associata ad un aumento della mortalità6,7.

La trombocitopenia è stata individuata in diversi studi6,7,58 come fattore prognostico negativo, in quanto associata ad un significativo aumento della mortalità, come riscontrato nel nostro studio. Anche per il profilo coagulativo la letteratura riflette quanto è emerso dal nostro studio, per cui il prolungamento del PT e/o dell’aPTT sono indicati come fattori prognostici negativi6,58,159_.