91 Le pareti intestinali sono state esaminate macroscopicamente per la ricerca di noduli tipici della coccidiosi o di vesciche contenenti eventuali cisticerchi.
Lo stomaco è stato aperto con una incisione dal piloro lungo la grande curvatura fino al cardias. Una volta aperto è stato svuotato del suo contenuto più grossolano e lavato accuratamente nell’acqua contenuta in un bicchiere conico di vetro della capienza di 1 litro. Anche in questo caso il materiale è stato lasciato sedimentare per almeno 30 minuti e il lavaggio è stato ripetuto fino ad ottenere un supernatante chiaro. Il sedimento poi è stato suddiviso in piccole aliquote, raccolto in piastre Petri e analizzato allo stereomicroscopio. Le pareti gastriche sono state osservate macroscopicamente.
Esame del sistema cardiorespiratorio
La ricerca dei parassiti nell’apparato cardiorespiratorio si è svolta attraverso l’esame della trachea, l’impronta polmonare e il lavaggio broncopolmonare e cardiaco.
La trachea è stata aperta longitudinalmente ed osservata allo stereomicroscopio.
La superficie del polmone è stata ispezionata attentamente per la ricerca di noduli contenenti protostrongili, i noduli rinvenuti sono stati incisi per farne uscire il parassita qualora presente. Sono state eseguite delle impronte di parenchima polmonare per apposizione di sezioni di esso sul vetrino portaoggetti, il vetrino è stato osservato al microscopio ottico per la ricerca di uova e forme parassitarie larvali.
Anche il cuore è stato ispezionato macroscopicamente per la ricerca di lesioni.
Infine gli organi sezionati sono stati lavati in un bicchiere conico e il liquido di lavaggio è stato lasciato riposare per almeno mezz’ora prima dell’esame del sedimento allo stereomicroscopio.
Esame del fegato
Il fegato è stato esaminato in primo luogo macroscopicamente per rilevare eventuali lesioni. La cistifellea e i dotti biliari sono stati esaminati separatamente. La cistifellea è stata trasferita in una capsula Petri, aperta e osservata allo stereomicroscopio per il rilevamento di parassiti adulti. I lobi epatici sono stati tagliati e sono state preparate delle impronte tissutali da osservare al microscopio ottico per la presenza di uova.
92 L’intero fegato è stato poi sezionato lungo le vie biliari, osservato allo stereomicroscopio per la ricerca di vermi adulti, lavato in un bicchiere conico e il liquido di lavaggio è stato sottoposto al procedimento di sedimentazione visto prima.
Esame del sistema urinario
L’esame dell’apparato urinario si basa sull’analisi dei reni e della vescica. Ciascun rene è stato aperto longitudinalmente seguendo la curvatura maggiore, creando una sezione cosiddetta “a panino”. Successivamente sono stati ispezionati macroscopicamente e poi lavati con acqua in un bicchiere conico. Il materiale ottenuto è stato raccolto in una piastra Petri e osservato allo stereomicroscopio.
La vescica urinaria è stata aperta e lavata in un bicchiere conico che è stato lasciato sedimentare per mezz’ora. Il sedimento è stato osservato allo stereomicroscopio per raccogliere vermi adulti.
Identificazione dei parassiti
Tutti i parassiti trovati sono stati isolati, contati, suddivisi per sesso e conservati in alcol al 70% e, per i cestodi, in AFA. La loro identificazione si è basata sull’osservazione al microscopio ottico seguendo le chiavi di Yamaguti (1959), Levine (1968), Soulsby (1982).
4.2.2 Esami coprologici utilizzati
4.2.2.1 Esame delle feci mediante flottazione
Questo metodo sfrutta il principio della differenza di peso specifico (p.s.) tra gli elementi parassitari e i detriti fecali. Gli elementi parassitari (oocisti, uova), quando immersi in una soluzione con peso specifico maggiore, tendono a salire in superficie, mentre i detriti fecali, essendo più pesanti, rimangono sul fondo della provetta. Le uova di molte specie di elminti hanno peso specifico compreso tra 1080 e 1400, per cui occorrono delle soluzioni aventi p.s. superiore a quello delle uova per ottenere l’affioramento. Numerose sono le soluzioni che sono impiegate per l’esame
93 coproscopico e a seconda dei loro differenti pesi specifici rendono possibile distinguere differenti parassiti:
- Soluzione a bassa densità con p.s. intorno a 1100 per la ricerca di oocisti di coccidi. Tale soluzione si ottiene effettuando una soluzione sovrasatura di cloruro di sodio (NaCl).
- Soluzioni a media densità con p.s. intorno a 1300 per la ricerca delle uova di tricostrongili, strongili gastro-intestinali e oncosfere di cestodi. Queste soluzioni possono essere preparate in 3 modi:
- Soluzione costituita in parti uguali da cloruro di zinco e cloruro di sodio - Soluzione contenente il 36% di zucchero e il 54% di nitrato di sodio (NaNO₃). - Soluzione Tampieri contenente una miscela di zinco solfato e iodio mercurato di
potassio.
- Soluzioni ad alta densità con densità intorno a 1450 per evidenziare le uova di
Dicrocoelium dendriticum, costituita da una soluzione di Iodio mercurato di potassio
(K₂HgI₄).
Il protocollo consiste nel:
Prelevare 2 g di feci da più parti del campione.
Stemperare le feci con il pestello in un mortaio insieme alla soluzione prescelta. Ottenuta una preparazione liquida omogenea, la si lascia riposare per qualche secondo. Dopo 1 minuto circa si può osservare se sulla superficie siano affiorati frammenti o vermi adulti o proglottidi di cestodi.
Filtrare tutto il contenuto del mortaio in un becker in plastica o vetro (100 mL) attraverso un colino da thè.
Versare il contenuto in una provetta a fondo cieco del volume di 10 mL avendo cura di formare un menisco superiore sulla superficie della provetta.
Porre un vetrino coprioggetto sulla parte superiore della provetta in modo che le forme parassitarie, man mano che affiorano, aderiscano alla faccia inferiore del vetrino.
94 Fare sostare il preparato per almeno 20 minuti e poi appoggiare il vetrino
coprioggetto su di un vetrino portaoggetto.
Effettuare la lettura al microscopio ottico prima a piccolo ingrandimento (4X) e poi a medio ingrandimento (10X) osservando tutta l’area del vetrino coprioggetto.
4.2.2.2 Coprocolture
Per valutare quali specie di coccidi sono presenti nei campioni, è possibile eseguire delle coprocolture in acqua di fonte contenente Bicromato di Potassio al 2,5%.
A causa del congelamento prolungato dei tratti digestivi delle lepri, la sporulazione delle oocisti non è stata possibile come metodo per la diagnosi differenziale di specie di
Eimeria. Dall’allevamento A è però stato possibile raccogliere delle feci fresche, che
sono state processate nel modo seguente:
Per la coltivazione, si seminano le feci stemperate in piastre Petri in strato sottile (in modo che ci sia una maggiore esposizione all’aria), al buio (perché la luce diretta inibisce la crescita) e a temperatura di circa 20° C.
Le colture sono quindi esaminate giornalmente per calcolare il tempo di sporulazione (cioè l’intervallo necessario perché le oocisti divengano infettanti). Vengono registrate le differenze relative al tempo di sporulazione, osservate nei due tipi di colture.
Le oocisti mature sono valutate morfometricamente al microscopio ottico e con un oculare micrometrico.
4.2.2.3 Esame delle feci mediante camera di McMaster
Per effettuare la conta delle oocisti e delle uova dei parassiti in una data quantità di materiale fecale ci si avvale della camera di McMaster. Essa è formata da due vetrini sovrapposti delimitati tra loro da uno spazio di 1,5 mm. Sul vetrino superiore sono disegnati due quadrati di 1 cm di lato, per cui il volume delle camere sottostanti è di
95 0,30 mL (0,15 mL a camera). Ogni singola camera è attraversata da 6 corridoi, che rappresentano l’area dove saranno contate le oocisti/uova.