HIV: HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS 1 Storia del virus

Nel 1981 vennero segnalati al Centers of Disease Control and Prevention diversi focolai di Sarcoma di Kaposi e Pneumocystis carinii in giovani omosessuali maschi, malattie che solitamente si riscontrano in soggetti con un Sistema Immunitario gravemente compromesso a causa di malattie genetiche, chemioterapia e trattamenti post-trapianto. I soggetti presentavano una grave immunodepressione a causa di una vasta gamma di alte infezioni virali ed altri sintomi che poi si rilevarono distintivi, quali affaticamento, febbre persistente, perdita di peso, diarrea e sintomi neurologici (Abrams 1984, Metroka 1983). Oltre agli omosessuali la sindrome presto di diffuse tra soggetti ad oggi definiti a rischio, come i tossicodipendenti, partner sessuali di soggetti infetti, immigrati ed emofiliaci. Per questi motivi, nel 1982 il Centers of Disease Control and Prevention la definì come “sindrome da immunodeficienza acquisita”, meglio conosciuta come AIDS [111].

L’isolamento e l’identificazione del virus avvenne l’anno successivo, inizialmente con il nome di ARV (Retrovirus AIDS Associato) ed a seguito è stato riconosciuto col nome di virus dell’immunodeficienza umana, HIV (Barre-Sinoussi et al., 1983; Gallo et al., 1984; Levy et al., 1984).

7.2. HIV

Il virus dell’HIV (Fig.59) proviene dalla famiglia dei Retrovirus, in particolare appartiene alla famiglia dei Lentivirus. Presenta un genoma a singolo filamento di RNA (ssRNA) racchiuso in un capside di forma conoide ulteriormente rivestito da pericapside. Il genoma (Fig.60) è costituito da 9 geni che codificano per 15 proteine, classificate come (Frankel & Young, 1998):

- proteine strutturali (Gag, Pol ed Env) Fig.59 Struttura del virus HIV - proteine regolatrici (Tat e Rev)

Fig.60 Struttura del genoma e delle singole proteine di HIV

Di queste, la poliproteina Gag-Pol-Env è scissa in singole proteine più piccole da tutti i tipi di retrovirus. Gag è ulteriormente divisa in 4 unità: matrice (MA), capside (CA), nucleocapside (NC) e p6. Env da origine ai componenti strutturali del core e dell’envelope, quali la glicoproteina 120 (gp120 o SU, come surface) e gp41 o glicoproteina transmembrana (TM). Infine Pol si divide in 3 enzimi essenziali, quali la proteasi (PR), la trascrittasi inversa (RT) e l’integrasi (IN). Oltre a queste, HIV codifica altre 6 proteine addizionali, dette accessorie, di cui tre si trovano nella particella virale (Vif, Vpr e Nef), altre due provvedono alle funzioni regolatorie del genoma (Tat e Rev) e l’ultima partecipa all’assemblaggio del virione (Vpu). Il virus presenta inoltre due molecole di RNA impacchettate nella particella [112].

Il virus HIV ha come bersaglio le cellule della linea linfoide, in particolare i linfociti T del tipo CD4. Questi ultimi hanno funzione regolatrice in quanto deputati alla produzione di linfochine, che coaudiuvano la risposta immunitaria e sono i linfociti T citotossici (CTL). Esistono anche i linfociti T di tipo CD8 che hanno funzione effettrice, cioè hanno il compito di eliminare gli organismi patogeni, e sono detti linfociti T helper (CTH). Solitamente i linfociti T CD8 sono in rapporto 1.5-2.0 con i CD4, il valore invertito di

queste molecole è un marker dell’infezione da HIV. Quest’ultima è caratterizzata da una grave immunodepressione che di conseguenza aumenta il rischio di ulteriori infezioni batteriche (Mycobacterium tubercolosis), virali (HSV, CMV), protozoiche (Toxoplasma gondii) e funginee (Pneumocystis carinii) che in soggetti immunocompetenti possono essere facilmente curate, nonché dell’insorgenza di tumori.

Il virus entra nella cellula per endocitosi attraverso il legame tra la glicoproteina dell’envelope gp120 ed il suo recettore presente su CD4 (Fig.61). Questo legame induce un cambiamento conformazionale che promuove un secondo legame con un co-recettore selettivo per le chemochine, che è un recettore a sette domini transmembranali associato a proteina G. Durante l’infezione ne sono coinvolti due tipi [113], CCR5 e CXCR4, così chiamati in riferimento al tropismo di HIV, un fenomeno che si osserva nel caso di interazioni tra il sistema immunitario ed il virus. In una prima infezione il virus aggredisce il monocita-macrofago (HIV è l’unico virus capace di infettare le cellule differenziate non replicative, come i macrofagi appunto), e per questo viene definito M-tropico. Il virus che attacca i linfociti T invece è definito T-tropico. I virus M-tropici si legano ai CD4 ed ai co- recettori CCR5, e vengono definiti R5. I virus T-tropici si legano sia a CD4 che ai co- recettori CXCR4, e per questo sono chiamati R4. Tuttavia, la forma predominante che si ritrova nel sangue durante la patogenesi dell’AIDS è R5. Esistono virus capaci di legarsi ad entrambi i co-recettori e sono detti R5X4 [114]. Il legame con questo co-recettore induce un ulteriore cambiamento di conformazione a carico della seconda subunità gp41 o glicoproteina transmembrana, che inserisce un peptide di fusione e consente al virus di entrare nella cellula (Fig.61).

Le cellule dendritiche della sottomucosa, solitamente infettate dai virus R5, processano ed espongono gli antigeni alle cellule del sistema immunitario. Esprimono una lectina detta DC-SIGN [115] che presenta alta affinità per gp120. Grazie al legame con questa struttura i virioni vengono internalizzati in un compartimento più acido (che favorisce il processo di spoliazione, come nel caso del virus dell’influenza) per poi essere successivamente riesposti sulla superficie della cellula dendritica matura e migrare nei linfonodi, dove richiamano linfociti T.

Fig.61 Ciclo replicativo di HIV

La gp41 è il principale mediatore dell’infezione. É assemblata come trimero sulla membrana del virione ed agisce come un arpione nei confronti dello strato lipidico della cellula ospite (ricco di chemochine), promuovendone l’ingresso [116].

Una volta all’interno e privato dell’envelope attraverso un processo favorito dalla fosforilazione della proteina Nef (con la stessa funzione del canale ionico M2 degli Orthomyxovirus), si genera un complesso di trascrizione inversa detto PIC (comprende il genoma a RNA, il primer di tRNA, l’integrasi, la matrice, il nucleocapside e Vpr) che passa nel nucleo e va incontro a diversi destini di cui uno solo darà origine al provirus funzionale.

Il provirus può integrarsi nel corredo cromosomico della cellula ospite dando origine sia a forme latenti che attive dell’infezione. Si viene a creare un serbatoio che può far riemergere la malattia ogni qual volta che le difese immunitarie si fanno più deboli, ciò spiega come anche le terapie antivirali più potenti non riescano ad sradicare il virus [117].

Una volta che tutte le componenti virali sono state assemblate, si forma il capside ed il virione maturo è liberato per gemmazione. Nel citoplasma avviene un processo di mistirilazione e palmitazione, in cui si assiste all’attacco irreversibile di acidi decatetranoici come l’acido mistirico e palmitico alle proteine [118]. Come risultato dall’envelope si forma un virione ricco in colesterolo ed acidi grassi che favorisce sia il rilascio che la fusione con altre cellule bersaglio. L’acido mistico infatti, è un acido

abbastanza idrofobico da essere incorporato nel doppio strato fosfolipidico delle membrane cellulari eucariotiche.

La presenza della proteina Nef gioca un ruolo importante nella replicazione virale e ne ottimizza il processo in quanto è in grado di influenzare i processi a cascata dei segnali del sistema immunitario, come l’attivazione dei linfociti T nonché la diminuzione dei linfociti CD4 [119]. La proteina Nef promuove inoltre il rilascio dei nuovi virioni dalla membrana della cellula ospite [120]. Nelle infezioni di scimmie e dell’uomo questa proteina è assente e questo è stato associato al rallentamento nella progressione clinica dell’infezione.

Nei confronti della cellula ospite il virus può provocare:

1) infezione latente, previa trascrizione, integrazione e replicazione garantendo una riserva di genoma virale.

2) infezione conclamata, in cui il virione esce dalla cellula e si riversa nel torrente circolatorio, continuandoo ad infettare un numero sempre più alto di linfociti CD4 e concentrandosi per la maggior parte nel sangue e nei fluidi genitali

Il periodo di latenza, che corrisponde a sieropositività asintomatica, può durare anche per anni, fin quando la malattia conclamata causa l’insorgenza di altre malattie indicative della sindrome da immunodeficienza, come polmonite, toxoplasmosi, tubercolosi e candida, nonché tumori, in particolare linfomi (Sarcoma di Kaposi) e carcinoma del collo dell’utero.

Il virus si trasmette soprattutto attraverso via ematica, sessuale e verticale madre-figlio.

7.3. Diffusione di HIV

Recentemente l’OMS ha annunciato che dal 2007 l’infezione da HIV si è stabilizzata, che i contagi continuano a scendere e che le morti da AIDS sono diminuite. Tuttavia, l’incremento della popolazione ha fatto salire il numero dei soggetti sieropositivi e l’AIDS rientra ancora fra le principali cause di morte a livello mondiale. La situazione peggiore è quella africana, dove i sieropositivi corrispondono al 68% del totale dei soggetti infetti. Nonostante la presenza di test gratuiti, di campagne di informazione e di mezzi di prevenzione, la maggior parte delle persone che convivono con l’HIV non ne è a conoscenza. (Pfizer Italia).

7.4 Terapia

7.4.1. Zidovudina (AZT)

Nel 1987 fu approvato ufficialmente il primo farmaco per il trattamento dell’AIDS: la 3’-azido- 2’, 3’-dideossitimidina, meglio nota come Zidovudina o AZT (l'abbreviazione AZT sta per azidotimidina e riprende il nome chimico). [121]. Questa molecola era già stata studiata in precedenza per le sue proprietà antivirali, antineoplastiche e antimetaboliche, ancor prima che l’HIV fosse scoperto [122].

Fig.62 Zidovudina

La Zidovudina (Fig.62) appartiene alla classe degli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTI), che agiscono sostituendo una versione difettosa di uno dei nucleosidi e causando l'interruzione prematura della catena del DNA provirale.

Come analogo nucleosidico, una volta attivato previa fosforilazione, compete con la timidina trifosfato per il legame con la trascrittasi inversa. La sua attività sulla DNA polimerasi γ coinvolge anche quella mitocondriale umana, determinando tossicità mitocondriale, acidosi e tossicità epatica (raramente cardiomiopatia e scompenso cardiaco sinistro). Gli effetti collaterali più comuni sono nausea, cefalea, astenia nonché tossicità midollare accompagnata da anemia e neutropenia spesso correlate al dosaggio del farmaco. É una molecola che penetra bene nel liquido cefalo rachidiano e quindi raggiunge meglio il tessuto nervoso rispetto ad altri antivirali. La terapia singola con AZT non è più utilizzata perché si è rilevata un debole trattamento per l’HIV e porta ad un rapido sviluppo di resistenza al farmaco. Zidovudina in monoterapia può essere assunta durante la gravidanza, al fine di evitare i possibili effetti collaterali di altri farmaci anti-HIV, ed è molto efficace nel prevenire la trasmissione verticale madre-figlio.

probabilità di sopravvivenza dei soggetti liberandoli dall'AIDS per lungo termine, e non riduce nemmeno i tassi di progressione della malattia nel breve termine. Tuttavia, questi studi hanno rivelato che l'aggiunta di un altro NRTI possa ritardare sia la progressione della malattia che la morte, aprendo la strada per la terapia di combinazione per il trattamento di HIV (paragrafo 7.4.6.).

Oggi l’AZT è impiegata in associazione con altri farmaci anti-retrovirali nella profilassi post-esposizione a materiale infetto (specialmente per il personale medico e paramedico). Il brevetto di GlaxoSmithKline sulla Zidovudina è scaduto nel settembre 2005. Di conseguenza, diverse versioni generiche del farmaco possono ora essere venduti nel Stati Uniti e l'Unione europea. Una versione generica denominata Zidovir® è fornita dal produttore indiano Cipla. Altre versioni generiche di Zidovudina includono Viro-Z® (Ranbaxy), Aviro-Z® (Ranbaxy) e Zido-H® (Genixpharma).

Zidovudina è inoltre disponibile in combinazione con Lamivudina in una formulazione, conosciuta con il nome commerciale Combivir® (GlaxoSmithKline). Ogni compressa contiene 300mg di Zidovudina e 150 mg di Lamivudina.

Successivamente all’AZT, sono stati immessi sul mercato: ddI o Didanosina (Videx®) e ddC o Zalcitabina (Hivid®), entrambi per il trattamento delle infezioni da HIV [122]. 7.4.2. Lamivudina (3TC)

Lamivudina (Fig.33), 2,3'-dideossi-3'-tiacitidina, detta anche 3TC, è un farmaco antivirale già descritto per la terapia dell’epatite B. É stata scoperta da Biochem Pharma ed è prodotta da GlaxoSmithKline con il nome commerciale Epivir®. É un inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa (NRTI). Nel 1996, la Lamivudina è stata autorizzata in Europa in combinazione con altri farmaci anti-retrovirali per il trattamento dell’HIV. Approvata per il trattamento delle co-infezioni epatite B/HIV, nell'Unione europea è conosciuta con il nome commerciale Zeffix® e negli Stati Uniti come Epivir-HBV® [123].

7.4.3. Stavudina

Nel 1994 fu commercializzata con il nome Zerit® l’analogo 2’-3’- dideossitimidinene o ddeThd conosciuto come d4T o Stavudina (Fig.63). Come l’AZT, una volta attivato in vivo per fosforilazione, agisce da terminatore di catena nella reazione che coinvolge la trascrittasi inversa [124].

Fig.63 Derivati di AZT

Fino a poco tempo fa, veniva utilizzata come trattamento base per le infezioni da HIV in combinazione con altri farmaci antivirali. Questa combinazione, come quella che prevede l’uso di Tenofovir Disopropil Fumarato, TDF (paragrafo 4.4.4.) è stata oggetto di molti studi [125]. Sia l’associazione con Lamivudina che con TDF sono paragonabili per attività, l’unica differenza è che TDF mostra una migliore affinità per i lipidi, infatti, nei soggetti che sono passati dalla terapia a base di d4T a quella con TDF, si è registrata la comparsa di dislipidemie [126].

7.4.4. Tenofovir

Una delle prime molecole descritte come agenti antiretrovirali è Tenofovir (Fig.35). In particolare, questa molecola ha dimostrato alta selettività verso il virus dell’HIV. Tenofovir è un inibitore nucleotidico (NtRTI) che agisce da terminatore di catena interagendo con la trascrittasi inversa. Dopo essere stato fosforilato a livello intracellulare dall’AMP-chinasi, viene incorporato nella DNA polimerasi RNA dipendente, bloccando l’allungamento del filamento nascente. Come nel caso dell’HBV, la molecola è stata

commercializzata nella sua forma di Tenofovir disopropile fumarato (TDF, Viread®) che presenta maggiore biodisponibilità se somministrato per via orale. Particolare importanza hanno assunto le combinazioni con Emtricitabina (Truvada®, Gilead Sciences) e la triplice combinazione con Emtricitabina + Efavirez (Atripla®). TDF è in commercio dal 2001, mentre Truvada® e Atripla® sono stati immessi in commercio rispettivamente nel 2004 e nel 2006. Le associazioni si sono dimostrate molto più attive della combinazione Zidovudina/Lamivudina/Efavirez [127].

7.4.5. CRIs (CO-receptors Inhibitors)

L’interesse dei co-recettori CCR5 e CXCR4 come bersaglio farmacologico risale al 1996, quando Ed Berger et coll. hanno dimostrato che il principale recettore CD4 dei linfociti usufruiva dei co-recettori CXCR4 e CCR5, i cui ligandi naturali sono le chemochine. Nel 1992 ci si accorse che in una preparazione a base di composti ciclici, un’impurezza dalla struttura biciclica risultò efficace nell’inibizione del processo di uncoating del virus HIV. Non riuscendo a riprodurre sinteticamente la stessa molecola, venne sintetizzato ex novo l’analogo biciclico JM3100, successivamente rinominato AMD3100 (Fig.64) [128]. É un potente analogo del co-recettore CXCR4 che blocca selettivamente l’entrata del virus. Analisi di struttura-attività hanno evidenziato che la porzione biciclica non è essenziale per l’attività, e uno dei due cicli può essere sostituito da un raggruppamento eterociclico come quello piridinico, come ad esempio AMD3465 e AMD 3451 [129], senza avere una riduzione dell’attività. Successive modifiche della molecola hanno portato alla struttura AMD070, che rappresenta un potenziale candidato a diventare un farmaco. La molecola è biodisponibile per via orale ed è selettiva per le infezioni da X4 virus. [130].

Nel 1999 Baba et al. hanno sviluppato la prima molecola antagonista selettiva nei confronti di CCR5, entrata in commercio con il nome di Maraviroc [131]. Successivamente sono stati proposti altri composti molto promettenti grazie alla buona disponibilità orale, come ad esempio TAK220 (Fig.65) [132].

Fig.64 AMD3100 Fig.65 TAK220

7.4.6. HAART

Con l’acronimo HAART (Hightly Active Anti-retroviral Therapy) ci si riferisce all’attuale terapia per la cura dell’AIDS che si base sull’uso contemporaneo di tre (o più) farmaci anti-retrovirali. Si parla di triplice terapia o terapia combinata. I farmaci che ne fanno parte possono avere sia azione extracellulare che intracellulare e appartengono a 4 classi [133]: 1) IF, inibitori della fusione

2) N(t)RTI, inibitori nucleosidici e nucleotidici della trascrittasi inversa 3) NNRTI, inibitori non nucleotidici della trascrittasi inversa

4) IP, inibitori della protease

La terapia è consigliata per quei soggetti che presentano livelli CD4 ≥ 350 cellule/mm3. Inizialmente può comprendere la combinazione di un NNRTI, quali Nevirapina ed Efavirenz insieme a due NRTIs come Zidovudina, Lamivudina, Tenofovir o Emtricitabina. Se questa terapia risultasse fallimentare, ogni paese sceglie una propria terapia di seconda scelta (WHO 2010).

Nevirapina (NVP) e Efavirenz (EFV) sono inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTI) che presentano azione simile (Fig.66). I fattori che determinano la scelta di uno anzichè dell’altro si basano sulla tossicità e sui costi di produzione. NVP presenta effetti collaterali come rash ed epatotossicità mentre EFV è generalmente ben tollerato, può essere somministrato una volta al giorno ma la sua sintesi è molto costosa, quindi meno disponibile rispetto a NVP. La sua tossicità interessa principalmente il sistema nervoso centrale. Tuttavia è il farmaco di prima scelta tra gli NNRTI nel trattamento delle co-infezioni HIV/Tubercolosi, in combinazione con l’antibiotico Rifampicina. I soggetti

che, per svariati motivi, non possono fare uso di EFV, la sostituiscono con NVP 200mg due volte al giorno [134].

Fig.66 Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa Attualmente, la terapia si basa sulle varianti di associazione tra questi farmaci.

Dal 2014 il Sistema Sanitario Nazionale ha assicurato la rimborsabilità per una della combinazioni di 4 principi attivi in un’unica formulazione [135]. Questa monopillola è alla base di: TDF 245mg/Emtricitabina 200gm/Elvitegravir 150mg/Cobicistat 150mg.

Recentemente Gilead Sciences ha presentato al Congresso europeo per l’AIDS (EACS) i risultati degli studi di fase III per il regime a dose unica somministrabile una volta al giorno di Elvitegravir 150mg/Cobicistat 150mg/Emtricitabina 200mg/TAF 10mg.

Tenofovir Alafenamide fumarato (TAF, Fig.67) è un inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa (NRTI) che ha dimostrato efficacia di 10 volte superiore a TDF e minori effetti collaterali in associazioni con altri antiretrovirali Rispetto alla combinazione cn TDF presenta minor effetti tossici a livello epatico ed osseo. [136].