L’identificazione di Gabra5 si è avvalsa della stessa procedura sperimentale impiegata nei primi due casi. Primers specifici disegnati sulla sequenza di Gabra5 in Rattus norvegicus ha permesso l’identificazione di una porzione dello stesso recettore nella nostra specie di interesse. In accordo con la minima distanza filogenetica tra le due specie, la lunghezza del tratto amplificato visualizzato su gel d’agarosio (1.5%) risulta essere paragonabile. I risultati della reazione di sequenza hanno fornito un frammento nucleotidico complessivo di 86 bp, poiché la parte iniziale e quella terminale del frammento presentano una perdita di purezza come visualizzato sui cromatogrammi mediante Finch TV versione 1.4.0. La sequenza è di seguito riportata:
>Gabra5 Mesocricetus auratus
5’AGCTTCCTCAGCCCCAGTGAAACCTTCTGAAGAGAAGACCGCCGAGAGTAAGAAAACCTACACAGCATC AGCAAGATCGA-3’
Per verificare se la sequenza ottenuta in Mesocricetus auratus corrispondesse realmente alla sequenza di Gabra5 di tale specie è stato realizzato l’allineamento
programma di allineamento disponibile online, al sito http://workbench.sdsc.edu, dotato della funzione BLASTN. Il successivo allineamento delle sequenze (CLUSTALW) ha evidenziato una percentuale di omologia con le sequenze nucleotidiche codificanti per Gabra5 superiori al 79% in Rattus norvegicus e Mus musculus, mentre nel caso di Homo sapiens, la percentuale di omologia è pari a 76% (fig. IV.7).
Consensus key (see documentation for details)
* - single, fully conserved residue - no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>Gabra5_Mus_musculus CCCATCCTCCAAACATCCCAAAAGAGCAGCCTCCAGCTGGGACCGCGAAT >Gabra5_Rattus norvegicus CCCATCCTCCAAACATCCCAAAGGAGCAGCTTCCAGGCGGGACTGGGAAT >Gabra5_Homo_sapiens CTCACCCCCCAAACATTCCGAAGGAACAGACCCCAGCAGGGACGTCGAAT >Gabra5_Mesocricetus ---CGGGAT * ** >Gabra5_Mus_musculus GCACC---CACAGTCTCCATCAAAGCTTCTGAAGAGAAGACTGCGGAGAG >Gabra5_Rattus norvegicus GCTGTGGGTACAGCCTCAATCAGAGCATCTGAGGAGAAGACTTCTGAGAG >Gabra5_Homo_sapiens ACAAC---CTCAGTCTCAGTAAAACCCTCTGAAGAGAAGACTTCTGAAAG >Gabra5_Mesocricetus GCTTC---CTCAGCCCCAGTGAAACCTTCTGAAGAGAAGACCGCCGAGAG * *** * * * * * * ***** ******** * ** ** >Gabra5_Mus_musculus TAAAAAGACATACAACAGCATCAGCAAGATCGACAAAATGTCCCGGATTG >Gabra5_Rattus norvegicus TAAAAAGACCTACAACAGCATCAGCAAGATCGACAAAATGTCCCGGATTG >Gabra5_Homo_sapiens CAAAAAGACTTACAACAGTATCAGCAAAATTGACAAAATGTCCCGAATCG >Gabra5_Mesocricetus TAAGAAAACCTACAACAGCATCAGCAAGATCGA--- ** ** ** ******** ******** ** ** Fig. IV.7. Allineamento nucleotidico tra la sequenza parziale di Gabra5 in Mesocricetus
auratus, quella di Mus musculus, Homo sapiens e Rattus norvegicus (cds parziale).
Gli asterischi in azzurro indicano l’identità nucleotidica.
Ricorrendo allo stesso sito http://workbench.sdsc.edu, è stata utilizzata la funzione SIXFRAME, che ha permesso di ottenere la traduzione aminoacidica del frammento nucleotidico, oltre che di verificare l’assenza di codoni di STOP.
>Gabra5 Mesocricetus auratus
RDASSAPVKPSEEKTAESKKTYNSISKI
Il frammento proteico così ottenuto di 28 aa è stato allineato con la sequenza aminoacidica di Gabra5 delle stesse specie considerate per l’allineamento nucleotidico. Successivamente, avvalendosi del software BIOEDIT Sequenze Allineament Editor, è stata calcolata la percentuale di identità e di similarità presentata da Mesocricetus auratus rispettivamente con ciascuna delle altre specie considerate (fig. IV.8 a,b).
a)Consensus key (see documentation for details) * - single, fully conserved residue
: - conservation of strong groups . - conservation of weak groups
- no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>Gabra5_Mus_musculus WDGKKALEAAKIKKKERELILNKSTNAFTTGKLTHPPNIPKEQPPAGTAN >Gabra5_Rattus norvegicus WDGKKALEAAKIKKKERELILNKSTNAFTTGKLTHPPNIPKEQLPGGTGN >Gabra5_Homo_sapiens WDGKKALEAAKIKKK-REVILNKSTNAFTTGKMSHPPNIPKEQTPAGTSN >Gabra5_Mesocricetus ---RD : >Gabra5_Mus_musculus AP-TVSIKASEEKTAESKKTYNSISKIDKMSRIVFPILFGTFNLVYWATY >Gabra5_Rattus norvegicus AVGTASIRASEEKTSESKKTYNSISKIDKMSRIVFPILFGTFNLVYWATY >Gabra5_Homo_sapiens TT-SVSVKPSEEKTSESKKTYNSISKIDKMSRIVFPVLFGTFNLVYWATY >Gabra5_Mesocricetus AS-SAPVKPSEEKTAESKKTYNSISKI--- : :..::.*****:************
b)
Mesocricetus auratus SIMILARITÀ (%) IDENTITÀ (%)
Rattus norvegicus 93% 67%
Mus musculus 92% 73%
Homo sapiens 93% 75%
Fig. IV.8. Allineamento del frammento nucleotidico di Gabra5 di Mesocricetus auratus con le altre specie (a). Gli asterischi in azzurro indicano un residuo aminoacidico completamente conservato, i due punti in verde la conservazione di gruppi forti, mentre il singolo punto azzurro la conservazione di gruppi deboli. (b) Tabella riassuntiva delle percentuali di similarità e identità calcolate tra la sequenza proteica di Mesocricetus auratus e quella relativa alle altre specie prese in esame. La sequenza parziale di Mesocricetus auratus è stata successivamente studiata da un punto di vista funzionale attraverso la predizione della struttura secondaria. L’identificazione di domini conservati tra Mesocricetus auratus ed una seconda specie potrebbe infatti fornire importanti indicazioni circa la funzione del tratto aminoacidico. Tale studio è stato realizzato sfruttando il software GOR4, presente all’indirizzo
http://npsa-pbil.ibcp.fr\cgi-bin\secpred_gib.pl. In particolare sono state confrontate le
predizioni della struttura secondaria di Mesocricetus auratus, di Rattus norvegicus, Mus musculus e sono stati ottenuti i seguenti risultati (fig. IV.9):
Query: Mesocricetus auratus Gabra5
Sequence RDASSAPVKP SEEKTAESKK TYNSISKI
Structure CCCCCCCCCC CCCCHHHHHC CEEEEEEC
GOR4:
Alpha helix (H) : 5 is 18% Beta Sheet (E) : 6 is 21% Random coil (C) : 17 is 61%
Query: Rattus norvegicus Gabra5
360 370 380 390 400 | | | | |
Sequence WDGKKALEAA KIKKKERELI LNKSTNAFTT GKLTHPPNIP KEQLPGGTGN
Structure HHHHHHHHHH HHHHHHHHHH HCCCCCCEEC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC
Sequence AVGTASIRAS EEKTSESKKT YNSISKIDKM SRIVFPILFG TFNLVYWATY
Structure CCCHHHHHHH HHHCCCCCCC EEEEEEECCC CEEEEEEEEC CCCEEEECEE
Sequence length: 28 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 10 is 36% Beta Sheet (E) : 7 is 25% Random coil (C) : 12 is 43%
Query: Mus musculus Gabra5
360 370 380 390 400 | | | | |
Sequence WDGKKALEAA KIKKKERELI LNKSTNAFTT GKLTHPPNIP KEQPPAGTAN
Structure HHHHHHHHHH HHHHHHHHHH HCCCCCCEEC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC
Sequence APTVSIKASE EKTAESKKTY NSISKIDKMS RIVFPILFGT FNLVYWATYL
Structure CCCHHHHHHH HHHHHHHCCC CEEEEECCCC EEEEEEEECC CCEEEECEEC Sequence length: 28 aa
GOR4:
Alpha helix (H) : 14 is 50% Beta Sheet (E) : 5 is 18% Random coil (C) : 9 is 32%
Fig. IV.9. Confronto tra la struttura di Gabra5 in Rattus norvegicus e in Mus musculus e la sequenza parziale ottenuta in Mesocricetus auratus, di cui sono riportati in valori percentuale le strutture secondarie.LEGEND: Alpha Helix = H Beta Sheet = E
Random Coil = C.