L’uso di primers disegnati sulla sequenza di Mtap2 di Rattus norvegicus ha consentito l’identificazione di una porzione del recettore nella specie Mesocricetus auratus. In accordo con la minima distanza filogenetica tra le due specie, la lunghezza del tratto amplificato visualizzato su gel d’agarosio (1.5%) risulta essere paragonabile. I risultati della reazione di sequenza hanno fornito un frammento nucleotidico complessivo di 152 bp, poiché la parte iniziale e quella terminale del frammento presentano una perdita di purezza come visualizzato sui cromatogrammi mediante Finch TV versione 1.4.0. La sequenza è di seguito riportata:
>mtap2_Mesocricetus auratus
5’- GAAAAGCTGGGAAGGCCACAGAGCTCAAGTTCGAGATGTCTCCAGAGCTGGCCCTC
TCGTCCAAAGAACCCAAGAAGAGGATTCATTCATGGGTGTTGAGTCTGGCCACATGAAAGAAGGTGCCAA AGTCAATGAAACAGAAGTCAAAGAG -3’
Per verificare se la sequenza ottenuta in Mesocricetus auratus corrispondesse realmente alla sequenza di Mtap2 di tale specie è stato realizzato l’allineamento nucleotidico di Mesocricetus auratus con le sequenze di altri Mammiferi, attraverso il programma di allineamento disponibile online, al sito http://workbench.sdsc.edu, dotato della funzione BLASTN. Il successivo allineamento delle sequenze (CLUSTALW) ha evidenziato una percentuale di omologia con le sequenze nucleotidiche codificanti per MAP2 pari al 80% in Rattus norvegicus e al 75% in Homo sapiens. (fig. IV.13).
Consensus key (see documentation for details)
* - single, fully conserved residue - no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>mtap2_Hom 3154 AAAATTAGTGACTTTGGACAGATGGCTTCAGGGCTAAACATAGATGATAGAAGGGCAACA >mtap2_Rattus AAAGTCAGTGACTTTGGACAGATGGCTTCTGGGATGAGTGTAGATGCTGGGAAAACCATA >mtap2_Mesocri ---GAAAAGCTGGGAAGGCCACA * * * * * * * * *
>mtap2_Homo GAGCTAAAACTTGAGGCTACACAGGACATGACCCCCTCATCCAAAGCACCGCAGGAGGCA >mtap2_Rattus GAGCTTAAGTTCGAGGTTGATCAGCAGCTGACTCTCTCATCCGAAGCACCTCAGGAAACA >mtap2_Mesocri GAGCTCAAGTTCGAGATGTCTCCAGAGCTGGCCCTCTCGTCCAAAGAACCTCAAGAAGAG ***** ** * *** * * ** * * *** *** *** *** ** ** >mtap2_Homo GATGCATTTATGGGTGTTGAGTCTGGCCACATGAAAGAAGGCACTAAAGTTAGTGAGACA >mtap2_Rattus GATTCATTCATGGGTATTGAGTCCAGCCACGTGAAGGATGGTGCCAAAGTCAGTGAAACA >mtap2_Mesocri GATTCATTCATGGGTGTTGAGTCTGGCCACATGAAAGAAGGTGCCAAAGTCAATGAAACA *** **** ****** ******* ***** **** ** ** * ***** * *** *** >mtap2_Homo GAAGTCAAAGAGAAGGTGGCCAAGCCTGACTTGGTGCACCAGGAGGCTGTAGACAAGGAG >mtap2_Rattus GAAGTCAAAGAGAAGGTGGCAAAGCCTGACTTGGTGCATCAGGAGGCTGTGGACAAAGAA >mtap2_Mesocri GAAGTCAAAGAG--- ************ Fig. IV.13. Allineamento nucleotidico tra la sequenza parziale di Mtap2 in Mesocricetus
auratus e quelle di Homo sapiens e di Rattus norvegicus (cds parziale). Gli
asterischi in azzurro indicano l’identità nucleotiodica.
Ricorrendo allo stesso sito http://workbench.sdsc.edu, è stata utilizzata la funzione SIXFRAME, che ha permesso di ottenere la traduzione aminoacidica del frammento nucleotidico, oltre che di verificare l’assenza di codoni di STOP. Il frammento proteico così ottenuto:
>mtap2_Mesocricetus auratus
KAGKATELKFEMSPELALSSKEPQEEDSFMGVESGHMKEGAKVNETEVKE
di 50 aa è stato allineato con la sequenza aminoacidica di MAP2 delle stesse specie considerate per l’allineamento nucleotidico. Successivamente, avvalendosi del software BIOEDIT Sequenze Allineament Editor, è stata calcolata la percentuale di identità e di similarità presentata da Mesocricetus auratus rispettivamente con ciascuna delle altre specie considerate (fig. IV.14 a,b).
a)Consensus key (see documentation for details) * - single, fully conserved residue
: - conservation of strong groups . - conservation of weak groups
- no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>mtap2_Homo EKAEKGLSSVPEIAEVEPSKKVEQGLDFAVQG----QLDVKISDFGQMASGLNIDDRRAT >mtap2_Rattus ERAEKGLSSVPEVAEVETTTKADQGLDVAAKKDDQSPLDIKVSDFGQMASGMSVDAGKTI >mtap2_Mesocri ---KAGKAT . :: >mtap2_Homo ELKLEATQDMTPSSKAPQEADAFMGVESGHMKEGTKVSETEVKEKVAKPDLVHQEAVDKE >mtap2_Rattus ELKFEVDQQLTLSSEAPQETDSFMGIESSHVKDGAKVSETEVKEKVAKPDLVHQEAVDKE >mtap2_Mesocri ELKFEMSPELALSSKEPQEEDSFMGVESGHMKEGAKVNETEVKE--- ***:* ::: **: *** *:***:**.*:*:*:**.******
b)
Mesocricetus auratus SIMILARITÀ (%) IDENTITÀ (%)
Rattus norvegicus 86% 68%
Homo sapiens 84% 66%
Fig. IV.14. Allineamento del frammento aminoacidico di MAP2 di Mesocricetus auratus con le altre specie (a). Gli asterischi in azzurro indicano un residuo aminoacidico completamente conservato, i due punti in verde la conservazione di gruppi forti, mentre il singolo punto azzurro la conservazione di gruppi deboli. (b) Tabella riassuntiva delle percentuali di similarità e identità calcolate tra la sequenza proteica di Mesocricetus auratus e quella relativa alle altre specie prese in esame. La sequenza parziale di Mesocricetus auratus è stata successivamente studiata da un punto di vista funzionale attraverso la predizione della struttura secondaria. L’identificazione di domini conservati tra Mesocricetus auratus ed una seconda specie potrebbe infatti fornire importanti indicazioni circa la funzione del tratto aminoacidico. Tale studio è stato realizzato sfruttando il software GOR4, presente all’indirizzo
http://npsa-pbil.ibcp.fr\cgi-bin\secpred_gib.pl. In particolare sono state confrontate le
predizioni della struttura secondaria di Mesocricetus auratus, di Rattus norvegicus e di Homo sapiens e sono stati ottenuti i seguenti risultati (fig. IV.15):
Query: Mesocricetus auratus MAP2
Sequence KAGKATELKF EMSPELALSS KEPQEEDSFM GVESGHMKEG AKVNETEVKE
Structure CCCCCEECCC CCCHHHHHHC CCCCCCCEEE EEEECHHHHC CCCCCEEEEC
Sequence length: 50 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 10 is 20% Beta Sheet (E) : 13 is 26% Random coil (C) : 27 is 54%
Query: Rattus norvegicus MAP2
1060 1070 1080 1090 1100 | | | | |
Sequence IKVSDFGQMA SGMSVDAGKT IELKFEVDQQ LTLSSEAPQE TDSFMGIESS
Structure EEEECCCCCC CCCEEECCCH HHHHHHHHHH HHHCCCCCCC CCCCCCEEEE
Sequence HVKDGAKVSE TEVKEKVAKP DLVHQEAVDK EESYESSGEH ESLTMESLKP
Structure CCCCCCEECH HHHHHHHCCC CHHHHHHHHH HHCCCCCCCH HHHHHHHCCC
Sequence length: 50 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 20 is 40% Beta Sheet (E) : 7 is 14% Random coil (C) : 23 is 54%
Query: Homo sapiens MAP2
1060 1070 1080 1090 1100 | | | | |
Sequence SDFGQMASGL NIDDRRATEL KLEATQDMTP SSKAPQEADA FMGVESGHM
Structure ECCCCCCCCC CCCHHHHHHH HHHHHHCCCC CCCCCHHHHH HHHHHCCCCC
Sequence EGTKVSETEV KEKVAKPDLV HQEAVDKEES YESSGEHESL TMESLKADEG
Structure CCCEECHHHH HHHHCCCCHH HHHHHHHHHC CCCCCCHHHH HHHHHHHHCC
Sequence length: 50 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 29 is 58% Beta Sheet (E) : 2 is 4% Random coil (C) : 19 is 38%
Fig. IV.15. Confronto tra la struttura di MAP2 in Rattus norvegicus e in Homo sapiens e la sequenza parziale ottenuta in Mesocricetus auratus, di cui sono riportati in valori percentuale le strutture secondarie.LEGEND: Alpha Helix = HBeta Sheet = E
Random Coil = C.