Analogamente a quanto riportato per le subunità GABAAergiche, l’impiego di
primers disegnati sulla sequenza di Syn di Rattus norvegicus ha permesso l’identificazione di una porzione dello stesso marcatore nella specie Mesocricetus auratus. In accordo con la minima distanza filogenetica tra le due specie, la lunghezza del tratto amplificato visualizzato su gel d’agarosio (1.5%) risulta essere paragonabile. I risultati della reazione di sequenza hanno fornito un frammento nucleotidico
complessivo di 158 bp, poiché la parte iniziale e quella terminale del frammento presentano una perdita di purezza come visualizzato sugli cromatogrammi mediante Finch TV versione 1.4.0. La sequenza è di seguito riportata:
>syn Mesocricetus auratus
5’-ACATTATCAAGCAGATGCCTGTGTGTCACCAGACAGGGAACACTTGCAAGGAACTGA
GGGACCCTGTGACTTCAGGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGTTGG CAACCTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGA -3’
Per verificare se la sequenza ottenuta in Mesocricetus auratus corrispondesse realmente alla sequenza di Syn di tale specie è stato realizzato l’allineamento nucleotidico di Mesocricetus auratus con le sequenze di altri Mammiferi, attraverso il programma di allineamento disponibile online, al sito http://workbench.sdsc.edu, dotato della funzione BLASTN. Il successivo allineamento delle sequenze (CLUSTALW) ha evidenziato una percentuale di omologia con le sequenze nucleotidiche codificanti per Syn pari al 95% in Rattus norvegicus e al 95% in Mus musculus. Nel caso di Homo sapiens, la percentuale di omologia è pari a 91% (fig. IV.10).
Consensus key (see documentation for details)
* - single, fully conserved residue - no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>Syn_Rattus norvegicus 483TGTGAAGATGGCCACGGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCCATGT >Syn_Mus musculus TGTGAAGATGGCCACTGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCTATGT >Syn_Mesocricetus ---ACATTATCAAGCAGATGCCTGTGT >Syn_Homo sapiens TGTGAAGATGGCCACAGACCCAGAGAACATTATCAAGGAGATGCCTGTCT *********** ******* * * >Syn_Rattus norvegicus GCCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCA >Syn_Mus musculus GCCGCCAGACAGGAAACACATGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCA >Syn_Mesocricetus GTCACCAGACAGGGAACACTTGCAAGGAACTGAGGGACCCTGTGACTTCA >Syn_Homo sapiens GCCGCCAGACAGGGAACACATGCAAGGAGCTGAGAGACCCTGTGACCTCG * * ********* ***** ******** ***** *********** ** >Syn_Rattus norvegicus GGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGT >Syn_Mus musculus GGACTCAACACCTCGGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGT >Syn_Mesocricetus GGACTCAACACCTCAGTGGTGTTTGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGT >Syn_Homo sapiens GGACTCAACACCTCGGTGGTGTTCGGCTTCCTGAACCTGGTGCTCTGGGT ************** ******** ************************** >Syn_Rattus norvegicus TGGCAACTTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCAGCCCCATTCA >Syn_Mus musculus TGGCAACCTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGCTGGGCCGCCCCATTCA >Syn_Mesocricetus TGGCAACCTATGGTTCGTGTTCAAGGAGACAGGA--- >Syn_Homo sapiens CGGCAACCTGTGGTTCGTGTTTAAGGAGACAGGCTGGGCCGCCCCGTTCC ****** * *********** ***********
Fig. IV.10. Allineamento nucleotidico tra la sequenza parziale di Syn in Mesocricetus auratus,
Mus musculus, Homo sapiens e Rattus norvegicus (cds parziale). Gli asterischi in
Ricorrendo allo stesso sito http://workbench.sdsc.edu, è stata utilizzata la funzione SIXFRAME, che ha permesso di ottenere la traduzione aminoacidica del frammento nucleotidico, oltre che di verificare l’assenza di codoni di STOP.
>Syn Mesocricetus auratus
IIKQMPVCHQTGNTCKELRDPVTSGLNTSVVFGFLNLVLWVGNLWFVFKETG
Il frammento proteico così ottenuto di 52 aa è stato allineato con la sequenza aminoacidica di Syn delle stesse specie considerate per l’allineamento nucleotidico. Successivamente, avvalendosi del software BIOEDIT Sequenze Allineament Editor, è stata calcolata la percentuale di identità e di similarità presentata da Mesocricetus auratus rispettivamente con ciascuna delle altre specie considerate (fig. IV.11 a,b).
a)Consensus key (see documentation for details) * - single, fully conserved residue
: - conservation of strong groups . - conservation of weak groups
- no consensus
CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment
>Syn_Mesocricetus ---IIKQMPVCHQTGNTCKELRDPVTS >Syn_Homo sapiens AFMWLVSSSAWAKGLSDVKMATDPENIIKEMPVCRQTGNTCKELRDPVTS >Syn_Rattus norvegicus AFMWLVSSSAWAKGLSDVKMATDPENIIKEMPMCRQTGNTCKELRDPVTS >Syn_Mus musculus AFMWLVSSSAWAKGLSDVKMATDPENIIKEMPMCRQTGNTCKELRDPVTS ***:**:*:*************** >Syn_Mesocricetus GLNTSVVFGFLNLVLWVGNLWFVFKETG--- >Syn_Homo sapiens GLNTSVVFGFLNLVLWVGNLWFVFKETGWAAPFLRAPPGAPEKQPAPGDA >Syn_Rattus norvegicus GLNTSVVFGFLNLVLWVGNLWFVFKETGWAAPFMRAPPGAPEKQPAPGDA >Syn_Mus musculus GLNTSVVFGFLNLVLWVGNLWFVFKETGWAAPFMRAPPGAPEKQPAPGDA ****************************
b)
Mesocricetus auratus SIMILARITÀ (%) IDENTITÀ (%)
Rattus norvegicus 100% 94%
Mus musculus 100% 94%
Homo sapiens 100% 96%
Fig. IV.11. Allineamento del frammento nucleotidico di Syn di Mesocricetus auratus con le altre specie (a). Gli asterischi in azzurro indicano un residuo aminoacidico completamente conservato, i due punti in verde la conservazione di gruppi forti, mentre il singolo punto azzurro la conservazione di gruppi deboli. (b) Tabella riassuntiva delle percentuali di similarità e identità calcolate tra la sequenza proteica di Mesocricetus auratus e quella relativa alle altre specie prese in esame. La sequenza parziale di Mesocricetus auratus è stata successivamente studiata da un punto di vista funzionale attraverso la predizione della struttura secondaria. L’identificazione di domini conservati tra Mesocricetus auratus ed una seconda specie potrebbe infatti fornire importanti indicazioni circa la funzione del tratto aminoacidico.
Tale studio è stato realizzato sfruttando il software GOR4, presente all’indirizzo
http://npsa-pbil.ibcp.fr\cgi-bin\secpred_gib.pl. In particolare sono state confrontate le
predizioni della struttura secondaria di Mesocricetus auratus, Rattus norvegicus, Mus musculus e sono stati ottenuti i seguenti risultati (fig. IV.12):
Query: Mesocricetus auratus Syn
Sequence IIKQMPVCHQ TGNTCKELRD PVTSGLNTSV VFGFLNLVLW VGNLWFVFKE
Structure CCCCCCEECC CCCCCEECCC CCCCCCCCCE EEEEEEEEEE CCCEEEEEEE
Sequence TG
Structure EC
Sequence length: 52 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 0 is 0% Beta Sheet (E) : 23 is 44.23% Random coil (C) : 29 is 55.77%
Query: Rattus norvegicus Syn
160 170 180 190 200 | | | | |
Sequence SSSAWAKGLS DVKMATDPEN IIKEMPMCRQ TGNTCKELRD PVTSGLNTSV
Structure CCHHHHHCCC CCCCCCCCCC EEECCCCEEE CCCCCCCCCC CCCCCCCCCE
Sequence VFGFLNLVLW VGNLWFVFKE TGWAAPFMRA PPGAPEKQPA PGDAYGDAGY
Structure EEEEEEEEEE CCCEEEEEEE CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC
Sequence length: 52 aa GOR4:
Alpha helix (H) : 0 is 0% Beta Sheet (E) : 24 is 46.15% Random coil (C) : 28 is 53.85%
Query: Mus musculus Syn
160 170 180 190 200 | | | | |
Sequence AFMWLVSSSA WAKGLSDVKM ATDPENIIKE MPMCRQTGNT CKELRDPVTS
Structure EEEEEECCHH HHHCCCCCCC CCCCCCEEEC CCCEEECCCC CCCCCCCCCC
Sequence GLNTSVVFGF LNLVLWVGNL WFVFKETGWA APFMRAPPGA PEKQPAPGDA
Structure CCCCCEEEEE EEEEEECCCE EEEEEECCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC
GOR4:
Alpha helix (H) : 0 is 0% Beta Sheet (E) : 24 is 46.15% Random coil (C) : 28 is 53.85%
Fig. IV.12. Confronto tra la struttura di Syn in Rattus norvegicus e in Mus musculus e la sequenza parziale ottenuta in Mesocricetus auratus, di cui sono riportati in valori percentuale le strutture secondarie. LEGEND: Alpha Helix = H Beta Sheet = E
Random Coil = C.