RNA, la tecnica di RT-PCR presenta dei li
’amplificazione stessa. La possibilità di ottenere dei falsi risultati ha portato inizialmente allo sviluppo di una tecnica di valutazione semiquantitativa nella quale i livelli di mRNA ottenuti per il messagero target vengono normalizzati rispetto ad un gene di riferimento usato come housekeeping, del quale viene considerata la quantità presente nella fase di amplificazione esponenziale (Chen et al., 1999). Negli ultimi 10 anni, tuttavia, anche la PCR semiquantitativa è stata spiazzata dalla tecnica Real Time PCR detta anche PCR quantitativa o più brevemente qPCR. In questo lavoro di tesi è stato utilizzato come gene housekeeping, per la valutazione quantitativa del pattern di espressione di MAP2 e Syp, il fattore citoscheletrico β-actina per il quale non sono state riportate variazioni sul pattern di espressione nel corso della maturazione ippocampale (Tanic et al., 2007). I primers impiegati per la reazione di amplificazione
della β-actina, disegnati su regioni altamente conservate della sequenza di Rattus norvegicus, sono riportati in Tabella II. I primers utilizzati per Syp e MAP2 sono identici a quelli utilizzati nella precedente fase di identificazione genica.
La quantificazione del numero di copie di DNA tramite qPCR si basa sulla conoscenza della cinetica dell’amplificazione che almeno inizialmente dovrebbe produrre da ogni
rammento i copie prima della PCR
Tal tivi. In primo luogo difficilmente per ogni
ciclo partendo da un frammento otteniamo sempre un ulteriore nuovo frammento ma in
In secondo luogo, la crescita esponenziale dei frammenti in una PCR avviene
normal reagenti e l’aumento dei
singola copia di frammento di DNA un’ulteriore copia alla fine di ogni ciclo della PCR (caratterizzato dalle fasi di denaturazione, annealing ed estensione) con un tasso di crescita di ciclo in ciclo pari a 2. Trattandosi di un meccanismo che si ripete ciclicamente, è caratterizzato da una crescita geometrica o esponenziale per cui idealmente si può scrivere:
X = X0 x 2C
X=numero di copie del f X0= numero d
C=numero di cicli
e cinetica è teorica per almeno due mo
media se ne ottiene una proporzione variabile tra 0 e 100%. Ciò equivale a dire che l’efficienza della PCR è spesso minore del 100% teorico ovvero in termini matematici:
X = X0 x (1 + E)C
dove E=efficienza della PCR (compresa tra 0 e 100%) emente solo nei primi cicli, dopochè la diminuzione dei prodotti residui (es. pirofosfato) inibisce la sintesi (fig. III.6):
La presenza di empre più efficaci permette comunque di studiare la PCR grazie a strumenti “real-time” nella sua fase esp
metodi di rilevamento per la quantità di DNA s
onenziale, mediante l’impiego di marcatori fluorescenti il cui accumulo, a livello del prodotto di reazione, segue la stessa cinetica della PCR. In questo lavoro è stato utilizzato lo strumento Bio-Rad. I campioni di cDNA ottenuti sono stati analizzati mediante qPCR utilizzando il SYBR Green (Quiagen) come indicatore di fluorescenza e verifica della specificità dei prodotti amplificati mediante curva di melting (fig. III.7). Il Syber green emette una fluorescenza 200 volte maggiore quando intercalato al DNA a doppia elica, quindi, con il procedere dei cicli di amplificazione, si assisterà ad un continuo aumento della fluorescenza (Morrison, 1998). Il ciclo raggiunto il quale la fluorescenza supera il valore base (threshold) viene indicato come Ct (Cycle threshold).
Fig. III.7. Curva di melting. Il colorante Syber si lega alle molecole di DNA a doppio filamento, intercalandosi nei solchi minori. La denaturazione del DNA che
I dati otte il metodo di quantificazione relativa
dell’algoritmo della derivata seconda. Tale metodo consente di valutare le differenze consegue all’aumento della temperatura ad ogni ciclo di amplificazione determina il distacco del colorante.
nuti sono stati analizzati mediante
nei livelli di espressione di un gene tra un campione ed il relativo controllo. Per poter effettuare tale confronto è necessario disporre di uno “standard interno”, di un riferimento, comune sia al campione trattato, sia al controllo ed espresso costitutivamente in entrambi. Tali geni costitutivi, denominati appunto housekeeping, sono caratterizzati dal fatto che la loro espressione segue l’attività trascrizionale della cellula: ne consegue che la quantità di RNA e quindi di cDNA utilizzato come templato
è ad essa proporzionale. Affinché tale valore possa essere utilizzato per ricavare l’entità dell’espressione differenziale del gene d’interesse tra il campione ed il suo controllo devono realizzarsi alcune condizioni. Una prima condizione riguarda l’efficienza della reazione di amplificazione per entrambi i geni, che dovrà essere quanto più possibile prossima al 100%. Tale parametro dovrà inoltre essere paragonabile tra il gene target e lo standard. Il metodo comunemente impiegato per il calcolo dell’efficienza di amplificazione è il seguente:
Efficienza (η) = [10(-1/slope) ] – 1
dove “slope” si riferisce al . La curva standard di un
campione mette in relazione il numero di cicli di amplificazione con la fluorescenza
La mix di reazione per ciascun campione è stata successivam do onto se trattasi di un gene di riferimento o di un gene target. Nel primo caso si è
μl μl
oni generali riportate nella seguente Tabella III.5: la pendenza della curva standard
emessa da un campione o, in modo più specifico, con la quantità di campione di partenza. Per la determinazione della curva standard (per ciascuna coppia i primers) si è proceduto con una diluizione seriale del templato a concentrazione nota:
5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl
ente allestita tenen c
preparata una mix costituita da:
• iQ SYBR Supermix 2X : 12.5 μl • Primer for (10 μM): 0,25 • Primer rev (10 μM): 0,25 • H2Onf : 10 μl • cDNA: 2 μl • Volume totale: 25 μl Rispettando quindi le condizi
20 μl H2O 20 μl H2O 20 μl H2O 20 μl H2O 20 μl H2O 50 ng/μl cDNA stock 10 ng 2 ng/ 0.4 ng/ μl 400 pg/μl 16 pg/μ .016 ng 0.8 ng/ μ 80 pg/ 0 l μl / l μl /μl μl
ariabile tra 200-400 nM. In tal caso, le condizioni generali di amplificazione sono state
μM): 0,5-1 μl er rev (10 μM): 0,5-1 μl
oni generali riportate nella seguente Tabella III.6: Tabella III.5. Condizioni generali di reazione in qPCR per un gene di riferimento.
Pe s,
ariabile tra 200-400 nM. In tal caso, le condizioni generali di amplificazione sono state
μM): 0,5-1 μl er rev (10 μM): 0,5-1 μl
oni generali riportate nella seguente Tabella III.6:
Tabella III.6. Condizioni generali di reazione in qPCR per un gene target.
Condizioni di reazione per gene housekeeping
Tabella III.5. Condizioni generali di reazione in qPCR per un gene di riferimento.
Per i geni target è stato necessario impiegare una concentrazione maggiore dei primerr i geni target è stato necessario impiegare una concentrazione maggiore dei primers, vv le seguenti: • iQ SYBR Supermix 2X : 12.5 μl • Primer for (10 • Prim le seguenti: • iQ SYBR Supermix 2X : 12.5 μl • Primer for (10 • Prim • H2Onf : 9,5-8,5 μl • H2Onf : 9,5-8,5 μl • cDNA: 2 μl • cDNA: 2 μl • Volume totale: 25 μl • Volume totale: 25 μl Rispettando quindi le condizi Rispettando quindi le condizi
Tabella III.6. Condizioni generali di reazione in qPCR per un gene target. Vo
replica
lume finale per singola PCR o 25 μl
Concentrazione finale primers gen riferimen
e di
to 0.1 μM per ciascuno Quantità cDNA templato per singola
PCR o replica 2 μl
Nr repliche per campione 3
Condizioni di reazione di un gene target
e finale per singola PCR o Volum
replica 25 μl
Concentrazione finale primers gen
riferimento e di 0.2-0.4 μM per ciascuno
Quantità cDNA templato per singola
PCR o replica 2 μl
Nel controllo negativo sono stati utilizzati 2 μl di acqua RNAsi free al posto del cDNA.
L’amp per
ata seconda. Brevemente, per ogni campione (analizzato in trip
itro
I risultati ottenuti da queste prime fasi sperimentali hanno portato in primo luogo porto biosintetico la cui applicazione per la cres
lificazione è stata condotta con i seguenti programmi: 15 minuti a 95°C attivare la Taq DNA polimerasi; 20 secondi alla temperatura di appaiamento che dipende dalla coppia di primers utilizzati; 15 secondi a 95°C per la denaturazione; 10 secondi a 72°C per l’estensione. Tali cicli sono stati ripetuti in media 40 volte. Per verificare che la reazione di amplificazione dei frammenti genici attesi fosse avvenuta correttamente, aliquote del prodotto di PCR sono state sottoposte a corsa elettroforetica su gel d’agarosio (1,5%).
I dati sono stati analizzati mediante il metodo di quantificazione relativa dell’algoritmo della deriv
licato) è stato individuato il valore di Ct del gene di interesse e di quello housekeeping. È stata quindi calcolata la loro differenza che rappresenta il ΔCt in modo tale che la quantità di ogni messaggero codificante il gene di interesse sia normalizzata rispetto al gene housekeeping. Per ogni gruppo (trattamento) è stato calcolato il ΔCt medio e la deviazione standard. La differenza tra il ΔCt di un qualsiasi gruppo di trattamento ed il ΔCt del gruppo controllo rappresenta il ΔΔCt, derivandone che il ΔΔCt del gruppo controllo è pari a zero. L’espressione matematica 2-ΔΔCt, che per il gruppo dei campioni controllo sarà quindi uguale ad 1, rappresenta il numero di volte (in più o in meno) in cui il gene di interesse è espresso rispetto all’espressione basale (quella riscontrata nei campioni non trattati). Con tale metodo, per ogni campione la quantità del gene di interesse analizzato è quindi espressa come n-volte rispetto alla quantità presente nelle cellule ippocampali non trattate. Tutti i dati sono espressi come media ± errore standard. L’analisi statistica è stata condotta mediante ANOVA two-way seguita dal test Neuman-Keul’s. I risultati ottenuti sono stati considerati statisticamente significativi per un valore di p<0.05.