Nonostante l'interazione tra T. gondii ed il sistema immunitario degli ospiti sia stata indagata sin dalla scoperta del parassita, più di cento anni fa, ancora oggi essa non è stata pienamente delucidata (Boothroyd 2009; Tait and Hunter 2009). La moltitudine di studi condotti e la conseguente abbondanza di dati raccolti sono, infatti, tra loro difficilmente correlabili a causa sia delle differenze con cui sono stati svolti i vari esperimenti sia per la difficoltà pratica dovuta al dover traslare da studi ed esperimenti condotti su roditori alla grande varietà di ospiti da studiare e confrontare. Tuttavia, è stato ampiamente dimostrato che nelle cellule infettate da T.
gondii più di 1000 geni vengono modulati dal parassita, tra cui quelli che codificano per le varie
proteine implicate nei processi infiammatori, apoptotici, metabolici, di differenziazione e crescita cellulare (Blader and Saeij 2009). Sappiamo che nella risoluzione della toxoplasmosi acuta intervengono sia la risposta immunitaria umorale che cellulo mediata, ma è quest'ultima la principale responsabile dei meccanismi di difesa dell'ospite contro il protozoo (Däubener and Hadding 1997; Innes 1997).
Una volta entrato nell'ospite, T. gondii incontra la prima barriera biologica dell'organismo: la mucosa intestinale. Gli enterociti che vengono infettati dal parassita subiscono modificazioni morfologiche e fisiologiche, di conseguenza iniziano a produrre chemochine e citochine che richiamano per chemiotassi i neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche che a loro volta rilasciano citochine proinfiammatorie (Buzoni-Gatel and Werts 2006). Nella prima fase della toxoplasmosi le cellule sopracitate vengono attivate dagli antigeni solubili dei tachizoiti e producono altissimi livelli di IL-12 (Gazzinelli et al. 1993; Johnson and Sayles 1997). In risposta alla produzione di IL-12, le cellule Natural Killer (NK) rilasciano INF-γ, il quale induce la differenziazione dei linfociti T nel fenotipo Th1 e stimola i macrofagi a produrre ROI (reactive oxygen intermediates), i quali conducono alla morte di T.gondii (Nathan et al. 1983). Infatti, IFN-γ è la citochina essenziale per la resistenza all'infezione acuta e cronica del protozoo (Suzuki et al. 1988; Gazzinelli et al. 1993). Insieme a IFN-γ altre citochine fondamentali che lavorano in sinergismo contro l'infezione del parassita sono il TNF-α, IL-6, IL-1 (Lang et al. 2007), IL-2 e linfotossina α. L'IL-2 viene prodotta dai CD4+ ed è un importante mitogeno per le cellule T (Tait e Hunter 2009). Le cellule CD4+ e CD8+ attivate prevengono la riattivazione dell'infezione attraverso la produzione di IFN-γ (Gazzinelli et al. 1992). I CD8+ giocano un ruolo cruciale nell'impedire al parassita di penetrare nelle cellule attraverso l'induzione dell'apoptosi delle cellule infettate (Däubener e Hadding 1997) e la neutralizzazione diretta di
31
T. gondii, intra ed extracellulare, mediante la produzione di perforine prodotte anche dalle
cellule NK. Un'altra funzione fondamentale del IFN-γ è l'attivazione della STAT1 che dimerizza formando un fattore di trascrizione (Tizard, 2004) che regola l'espressione delle iNOS, ossia le NO sintasi responsabili della produzione da parte dei macrofagi dell'NO (ossido nitrico) a partire dall'arginina. L'ossido nitrico agisce in sinergismo con gli altri anioni perossidi per produrre potenti ossidanti in grado di attraversare tutte le barriere biologiche, compresa la PVM del protozoo, modificare proteine in gruppi tiolici reattivi, gruppi eme e clusters di ferro e zolfo che inibiscono varie vie metaboliche del parassita. Le iNOS sono coinvolte anche in un altro processo di inibizione della replicazione e proliferazione del parassita, meno caratterizzato, che deriva dalla deplezione dell'arginina, amminoacido essenziale per la crescita di T. gondii. Questo ruolo delle iNOS è predominante non tanto nella fase parassitemica, quanto invece nell'infezione cronica a livello del tessuto nervoso nel SNC (Scharton-Kersten et al. 1997). L'IFN-γ interviene anche nell'induzione delle IGRs, un gruppo di proteine definite GTPasi associate all'immunità. Queste proteine sono largamente distribuite nei vertebrati e gli studi dimostrano la loro importanza nella resistenza degli organismi ad una grande varietà di patogeni intracellulari, tra cui appunto T.gondii (Taylor et al. 2000). Sempre l’IFN-γ induce la indoleamina2,3-deidrogenasi che provoca la deplezione del 1-triptofano e quindi l'inibizione della crescita del parassita (Fujigaki et al. 2002).
L'immunità innata dell'ospite è la protagonista principale nella fase primaria di resistenza all'infezione e nella patogenesi della toxoplasmosi (Gazzinelli et al. 1994). I Toll-like receptors (TRL) sono una famiglia di recettori appartenenti all'immunità innata specializzati nel riconoscimento delle PAMPs “pathogen-associated molecular patterns”, fondamentali molecole espresse dal parassita ma non dalle cellule dell'ospite (Pifer e Yarovinsky 2011), anche se in effetti i ligandi in grado di stimolare questi recettori non sono stati ancora completamente scoperti. I TRL appartengono ad una famiglia di recettori glicoproteici presenti sulla superficie delle membrane cellulari e all'interno del citoplasma, espressi nei leucociti, come macrofagi e cellule dendritiche, ma anche nelle cellule epiteliali del tratto enterico e respiratorio. Quelli a cui è stato riconosciuto avere un ruolo predominante nel riconoscimento di T. gondii sono TRL2, TRL4, TRL7, TRL9, TRL11 e TRL12. Il TRL11 ha la funzione di riconoscere la profilina, una molecola chiave prodotta da T. gondii che regola, assieme al complesso APR, la motilità attraverso la polimerizzazione e depolarizzazione dell'actina e interviene nella replicazione del parassita. Si pensa che il riconoscimento della profilina da parte delle cellule dendritiche avverrebbe anche prima del diretto contatto col protozoo, mediante un meccanismo a distanza. In sinergismo col TRL11 agisce anche il TRL12, sebbene le dinamiche della loro
32
cooperazione sono ancora oggetto di studio. Secondo l'ipotesi finora formulata, si realizza un contatto diretto tra i due recettori e la profilina, da cui originano i complessi profilina-TRL11 e profilina-TRL12 (Raetz et al. 2013) che attivano una cascata di segnali di trasduzione secondo diverse vie e proteine che culmina con l'innesco della MyD88 (Myeloid differentiation primary gene 88). Questa è una proteina centrale nel riconoscimento di vari patogeni attraverso differenti TRL. Una volta innescata dai complessi della profilina coi TRL11 e TRL12, la MyD88 lega varie chinasi guidando l'attivazione della forma citosolica inattiva del fattore- kappa β (NF-kβ) che a livello del nucleo modifica il profilo di trascrizione della cellula, indirizzandola verso la produzione di varie citochine tra cui la IL-12, il cui fondamentale ruolo è stato descritto in precedenza. In assenza del TRL-11, l'attivazione della MyD88 può essere indotta da altri due TRL: il TRL-7 ed il TRL-9 (Andrade et al. 2013). Il TRL-7 è un recettore che lega gli RNA a singola catena, come quello prodotto da T.gondii, e per la cui attivazione sono necessari sia l'uridina che il ribosio che compongono questi RNA. Comunque, lo specifico meccanismo attraverso cui il TRL-7 regolerebbe l'attività immunitaria contro il parassita ed il perchè la sua funzione si evidenzi solo in assenza del TRL-11 sono dettagli non ancora chiariti, mentre sappiamo che questo recettore non è espresso né nei CD8+ né nelle cellule dendritiche (Edwuards et al. 2003), che come detto in precedenza, sono i protagonisti centrali nel riconoscimento di T.gondii. Il TRL-9 è stato dimostrato essere necessario per scatenare la risposta immunitaria Th1 contro l'infezione orale da T. gondii (Oykhman e Mody 2010), ma per ragioni ancora sconosciute, la sua attivazione non è stata osservata nelle cellule dendritiche sebbene esse lo esprimano, mentre è stato accertato che per rendere questo recettore responsivo al protozoo è essenziale il precedente innesco del IFN-γ (Andrade et al. 2013). Il TRL-2 è un recettore deputato, solitamente in cooperazione col TRL-1, al riconoscimento degli antigeni GPI (glicosilfosfatitilinositolo) ancorati alla superficie di Toxoplasma, dei quali il più studiato è il SAG1. È espresso non solo dai macrofagi ma anche dalle cellule epiteliali e la sua attivazione conduce alla produzione di varie citochine, con principale effetto sulla produzione da parte di macrofagi e neutrofili rispettivamente di TNFα (tumor necrosis factor) e CCL2 (CC- chemochina ligando 2), importanti per la resistenza dell'ospite al protozoo (Hunter et al. 1995; G.S.Yap et al. 1998). Il TRL-4 è attivato in vitro dalle GPI di toxoplasma (Debierre-Grockiego et al. 2007) e come il TRL-2 è attivato dal contatto con la heat-shock protein 70 di T. gondii. Secondo un esperimento i TRL-9, TRL-2 e TRL-4, se hanno un ruolo marginale nella prodduzione della IL-12 in risposta all'infezione, sono invece necessari regolatori dell'immunità mediata dal INF-γ contro la toxoplasmosi contratta per via orale e la loro attivazione è mediata indirettamente dai batteri commensali presenti nel tratto intestinale (Benson et al. 2009;
33
Heimessat et al. 2007).
Le NLRP sono una famiglia di proteine che hanno la funzione di recettori citosolici ed è stato recentemente scoperto, da esperimenti condotti su roditori, che anch'esse partecipano al sistema innato di identificazione di T.gondii. Sebbene i dettagli dell'interazione delle NLRP col protozoo siano ancora da chiarire (Ewald et al. 2014), il legame con questi recettori innesca l'assemblaggio di un complesso di proteine chiamate infiammasomi, i quali reclutano la caspasi 1, enzima che interagisce con le forme inattive pro-IL1, pro-IL6 e TNFα attivandole. Il TNFα è un mediatore prodotto dalle cellule sentinelle come i macrofagi, le cellule dendritiche, le cellule endoteliali, la microglia e le cellule T in risposta a diverse PAMPs, come appunto gli antigeni di T.gondii. La sua funzione consiste nell'innescare varie vie di trasduzione del segnale, come il già citato NF-kβ, con la conseguente produzione di altre citochine da parte delle cellule adiacenti, e nel promuovere l'aderenza, la migrazione, l'attrazione e l'attivazione dei leucociti, inducendo modificazione nell'endotelio vascolare. Inoltre, il TNFα promuove la presentazione degli antigeni di toxoplasma alle cellule T e la loro conseguente attivazione, perciò l'evoluzione dall'immunità innata a quella adattativa (Tizard 2004), oltre a collaborare con l'IFN-γ nel favorire i meccanismi antiparassitari nei macrofagi come nelle cellule non ematopoietiche (Yap&Sher 1999). È stato sperimentalmente dimostrato che il TNFα non è necessario nel meccanismo mediato dalle IGR per l'eliminazione del parassita (Schlüter et al. 2003), dato confermato in vitro dalla mantenuta capacità dei macrofagi di uccidere il protozoo anche in assenza di tale molecola (Zhao et al. 2007), ma la corretta interpretazione di tali risultati è stata complicata dalla scoperta che il TNFα agisce maggiormente nell'attivare i macrofagi se la concentrazione di IFN-γ è bassa (Yap et al. 1998). Il CD40L, o CD152, è un altro componente della famiglia dei tumor necrosis factors coinvolto nell'immunità contro T.gondii. È espresso sulle cellule T e lega il CD40 presente sulla superficie dei macrofagi e altre popolazioni cellulari, promuovendo un'ottimale produzione di IFN-γ e il corretto switch degli anticorpi (Leiva et al. 1998). Il CDL40 è in grado di inibire la replicazione del protozoo sia sinergicamente col IFN-γ che indipendentemente da esso (Subauste&Wessendarp 2006).
Nonostante, come detto inizialmente, la risposta immunitaria umorale giochi un ruolo più marginale nella resistenza alla toxoplasmosi nella fase acuta (Sharma 1990), comunque gli antigeni del parassita stimolano la produzione di anticorpi. Le immunoglobuline, oltre che per la loro funzione protettiva, sono le molecole chiave per la diagnosi della toxoplasmosi, permettendo la distinzione tra i soggetti appena infettati e quelli invece già nella fase cronica della parassitosi. Per promuovere un'adeguata risposta umorale da parte dei linfociti B, è
34
ovviamente necessaria una corretta attivazione ed azione dei linfociti T helper: sperimentalmente è stato dimostrato come i roditori deficienti o privati delle cellule T CD4+ manifestino scarsi titoli di anticorpi specifici contro il parassita.
Le immunoglobuline principalmente prodotte sono IgM, IgG e IgA (Correa et al. 2007), e possono intervenire secondo vari meccanismi come guidando la neutralizzazione e l'inibizione dell'invasione cellulare del parassita, l'attivazione della via del complemento e l'infiammazione (Däubener e Hadding 1997; Correa et al 2007).
Gli IgG sono gli anticorpi principalmente coinvolti nella risposta umorale alla toxoplasmosi ed uno specifico isotipo, l'IgG1, negli uomini e nei roditori, può esplicare un ruolo importante attraverso meccanismi come la fissazione del complemento, l'opsonizzazione o la citotossicità anticorpo-dipendente. Negli uomini, il picco massimo di IgG viene raggiunto intorno ai 6-14 mesi postinfezione, poi decrescono successivamente ma l'ospite rimane reattivo per sempre. Invece, titoli veramente elevati di IgG sono indicativi di infezione acuta (Sharma 1990; Denkers e Gazzinelli 1998).
Gli IgM specifici indicano un'infezione contratta recentemente, non una reinfezione poiché minimi titoli di IgG sopprimono la produzione di IgM (Hegab e Al-Mutawa 2003), e nei soggetti adulti persistono frequentemente nel siero per oltre sei mesi. Probabilmente, la sopravvivenza a lungo termine degli IgM è dovuta a microriattivazioni delle cisti tissutali e alla generazione di etero/autoantigeni cross-reattivi (Correa et al. 2007).
Durante la fase intestinale vengono rilasciati gli IgA, i quali possono essere prodotti anche a livello oculare in caso di infezione acuta o reinfezione, ma non in caso di toxoplasmosi acuta (Hegab e Al-Mutawa 2003). Prima, infatti, della comparsa degli IgG viene sempre attivata la risposta IgA ed essa è regolata dall'azione dell'IL-10 e del TGF-β (Corea et al. 2007). Recentemente uno studio ha dimostrato che gli IgE sono in grado di indurre l'eliminazione del parassita intracellulare dai macrofagi umani attraverso la loro capacità di innesco del segnale CD23, in dipendenza del NO e sotto il controllo dell'IL-10 (Vouldoukis et al. 2011).
L'equilibrio tra le citochine infiammatorie (IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1) e quelle antinfiammatorie (TGF-β e IL-10) è decisivo nel determinare il successo dell'infezione di T.gondii (Lang et al. 2007). Il-10, per esempio, è funzionale al controllo della produzione di citochine e chemochine infiammatorie, prevenendo un'incontrollata produzione di IFNγ e TNF-α durante la fase parassitemica della toxoplasmosi (Aliberti 2005), contribuisce alla soppressione delle funzioni dei linfociti T e si pensa che sia fondamentale nel controllo dell'immunopatologia di T.gondii (Tait e Hunter 2009).
35
Un'altra molecola importante per la funzione regolatrice antinfiammatoria è la lipoxina, un eicosanoide la cui produzione viene stimolata dagli antigeni solubili dei tachizoiti (STAg) e che agisce inibendo la migrazione delle cellule dendritiche ed ostacola, in vivo e in vitro, la IL-12 (Aliberti et al., 2002 a,b).
La IL-27 è stata recentemente aggiunta alle citochine antinfiammatorie coinvolte nella modulazione della patogenesi della toxoplasmosi (Tait e Hunter 2009). Gli esperimenti in vivo condotti su roditori dimostrano che i soggetti deficienti nei recettori per la IL-27 producono un'aberrante risposta IL-2 che porta ad esiti fatali dell'infezione, mentre la deplezione della IL- 2 prolunga la sopravvivenza anche nelle cavie IL-27R-/-. Questi risultati avvalorano l'ipotesi che l'IL-27 limiti la produzione di IL-2 durante la differenziazione delle cellule Th1 (Villarino et al. 2006).
Tuttavia, come tutti i protozoi anche T. gondii ha evoluto meccanismi vari per sfuggire alla risposta immunitaria degli ospiti immunocompetenti, come per esempio il mascheramento e/o la variazione degli antigeni, il blocco dei fattori serici, la localizzazione intracellulare e l'immusoppressione (Seed 1996). In particolare, nell'arsenale dei fattori di virulenza di T.gondii i più caratterizzati sono ROP18, ROP5, ROP16, ROP38, GRA16 e GRA24.
ROP18 è una chinasi prodotta nel bulbo dei rhoptries dei tachizoiti nella fase iniziale dell'invasione. Essa può fosforilare i residui critici di treonina (T102 e T108) dei siti di legame di Irga6 e Irgb6 (IGRs) che attaccano il PVM. In questo modo, impedisce la oligomerizzazione delle subunità e l'idrolisi del GTP destabilizzando la Igra6 e quindi inibisce l'accumulo di IGR sul PVM, proteggendo il parassita dalla distruzione (Pawloski et al. 2011). Un altro target cellulare su cui si esplicherebbe l'azione del ROP18 sarebbe il fattore di trascrizione ATF6β presente nel reticolo endoplasmatico delle cellule ospiti, che potrebbe avere un ruolo nella presentazione dell'antigene (Yamamoto et al. 2011), ma i dettagli di tale interazione sono ancora da dimostrare. Tuttavia ROP18 non è egualmente espresso nei tre tipi di T. gondii ed il fatto che il tipo II del protozoo, nonostante esprima questa chinasi, non sia in grado di fosforilare le IGR nei macrofagi attivati dall'IFN-γ suggerisce che questa molecola lavori in sinergismo con un'altra proteina effettrice del parassita, carente nel tipo II. Essa potrebbe essere la ROP5 dato che la sua deplezione nel tipo I riduce drasticamente la sua virulenza, e agirebbe attivando allostericamente la ROP18 proteggendo toxoplasma dagli effettori dei meccanismi antimicrobici (Behnke et al. 2012).
ROP5 è una pseudochinasi cioè una proteina che funziona da impalcatura per la regolazione del processo enzimatico di trasferimento del gruppo fosfato, più che da chinasi vera e propria.
36
Viene prodotta durante la fase di invasione cellulare e ne esistono diverse isoforme, ma i tre tipi di T. gondii ne possiedono le tre principali. La molecola si localizza sul PVM ma non sembra avere ruolo né nell'invasione, né nella formazione del PV, né nell'acquisizione di nutrienti, né nella replicazione del parassita o nell'uscita dalle cellule, ma l'espressione della ROP5 ha importanti ripercussioni sulla virulenza dei tachizoiti di toxoplasma. Infatti, come detto poco prima, ci sono evidenze sperimentali della cooperazione tra la ROP5 e la ROP18 per eludere il meccanismo di difesa delle IGR a vantaggio di una maggiore virulenza del protozoo (Behnke et al. 2012).
La ROP16 è anch'essa una chinasi prodotta nella primissima fase di invasione, ma questa viene trasferita al nucleo delle cellule ospiti per indurre grandi modificazioni in varie vie di espressione genica. Come visto anche per le altre ROPs, essa è differentemente espressa dai tre tipi del parassita: la ROP16 dei tipi I e III ma non del tipo II è in grado di fosforilare i fattori di trascrizione STAT3 e STAT6. La modificazione di queste proteine provoca una down regulation dell'induzione della IL12 con conseguente limitazione delle citochine prodotte dalla risposta Th1, e ciò può condurre ad una meno intensa risposta infiammatoria e a meno gravi lesioni patologiche, ma favorisce anche la sopravvivenza del parassita. È inoltre plausibile che la ROP16 possieda altri targets molecolari dal momento che molti dei geni da essa alterati nel nucleo delle cellule ospiti non possiedono elementi per legare i fattori di trascrizione STAT (Melo et al. 2011). In vivo tuttavia la ROP16 non ha grandi effetti nel determinismo della virulenza di T.gondii: la delezione dell'allele per questa proteina non riduce la mortalità degli ospiti a seguito dell'infezione intraperitoneale. Questo potrebbe essere dovuto all'equilibrio dei due opposti ruoli dell'argininasi indotta dall'attivazione della STAT6: quello di favorire la crescita del parassita in opposizione a quello di limitarne l'accesso all'arginina, amminoacido essenziale per la crescita stessa (Denkers et al. 2012). La predominanza dell'uno o dell'altro effetto determina la persistenza o l'eliminazione del protozoo in vivo (Hunter e Sibley 2012). Invece, l'infezione del parassita di tipo II induce più alti livelli di IL12 in risposta agli effetti non solo della differente isoforma della ROP16 ma anche della GRA15, la quale attiva il NF- kβ. La ROP16 dei tipi I e III induce l'enzima arginasi associato ai macrofagi attivati per vie alternative che producono molecole antinfiammatorie, mentre l'attivazione del NF-kβ da parte della ROP16 e della GRA15 del tipo II di toxoplasma porta all'attivazione classica dei macrofagi che rilasciano citochine e chemochine ad attività antimicrobica. Ecco come due varianti della stessa proteina effettrice possono guidare risposte antagoniste nei macrofagi infettati, con effetti sulla risposta infiammatoria e il controllo del parassita (Hunter e Sibley 2012).
37
La ROP38 è una proteina dei rhoptries recentemente scoperta che mostra più alti livelli di espressione nei tachizoiti di tipo II e III invece che in quelli di tipo I, e che viene prodotta in quantità sedici volte superiore nei bradizoiti rispetto ai tachizoiti. Gli studi dimostrano che questa chinasi non ha alcun tipo di interazione con le IGR ma piuttosto interviene nel mantenimento degli stati cronici dell'infezione in vivo. Tuttavia sono necessari ancora ulteriori studi che caratterizzino più dettagliatamente il ruolo di questa chinasi (Fox et al. 2016).
GRA16 è una proteina ad alto peso molecolare che durante la crescita intracellulare dei tachizoiti transita attraverso la via dei granuli densi per essere secreta nello spazio vacuolare da cui oltrepassa il PVM per raggiungere il citoplasma della cellula ospite, con meccanismo ancora sconosciuto. Nel citoplasma si sposta fino a raggiungere il nucleo dove va a formare complessi stabili con due enzimi quali la proteasi USP7 (ubiquitin-specific-processing) e l'oloenzima PP2A-B55, che regolano la p53, proteina centrale coinvolta in differenti vie molecolari e protagonista principale del controllo della risposta glicocorticoidea infiammatoria. La GRA16 quindi contribuirebbe a limitare la risposta infiammatoria coinvolgendo i due enzimi USP7 e PP2A-B55 nel mantenere livelli basali della p53 (Bougdour et al. 2014).
La GRA24 invece penetra direttamente attraverso il PVM e va a localizzarsi nel nucleo dell'ospite, a legare esclusivamente una proteina, la p38αMAPK (Mitogen-Activator Factor Protein Kinase p38α). L'attivazione della via della MAPK conduce ad una cascata enzimatica che culmina con la fosforilazione di una specifica MAPK, che regola positivamente o negativamente l'espressione genica inducendo i fattori di trascrizione. La IL12 ed altre citochine sono parzialmente controllate da queste proteine, pertanto è stato proposto che la maggior produzione di IL12 nelle infezioni da parte del tipo II del prassita siano frutto del sinergismo tra la GRA15 e la GRA24 e ciò favorirebbe l'infezione a lungo termine, mantenendo basso il numero di protozoi.